На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию

С появлением антиретровирусной терапии, эпидемия СПИДа в западном мире было замедлено, но не урезаны, а распространение ВИЧ по-прежнему является основным бременем для здравоохранения во всем мире. За исключением минимально эффективное RV144 испытание Thai, вакцины против ВИЧ до сих пор показано неспособностью защитить от инфекции. Таким образом, исследования по дополнительным, потенциальные терапевтические цели по-прежнему оправдано.

Наряду с CD4 Т-клеток, персистирующая генерализованная активация иммунной системы является отличительной чертой ВИЧ-инфекции. Эта хроническая активация иммунной системы (CIA) приводит к увеличению обновления клеток, активированных и дифференцированные субпопуляциями, сотовая истощение и старение, и убийство Т-клеток и В-клеток с помощью активации индуцированных гибель клеток (AICD) ^1,2,3, и она хорошо известна как одна из самых сильных предикторов прогрессирования заболевания ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Тем не менее, механизмы, лежащие ЦРУ и CD4Т-клеток при ВИЧ-инфекции еще предстоит полностью не выяснены.

Данные, полученные в нашей лаборатории и другие привели нас к модели прогрессирования заболевания (рис. 1), где белок ВИЧ Неф (негативный регуляторный фактор) индуцирует его секреции в экзосомах от ВИЧ-1 инфицированных клеток ^13,14. Эти Nef содержащих экзосомы (exNef) индуцируют апоптоз в ряде клеточных линий, включая неинфицированные CD4 Т-клеток ^15,16. Кроме того, в моноциты / макрофаги exNef изменяет экспрессию генов узоры, например, выражение цитокинов, и, кажется, вызывает состояние иммунной активации незапланированное. Этот данных свидетельствует о важной роли exNef в ЦРУ и CD4 Т-клеток.

Понимание механизмов, лежащих в основе способности Nef, чтобы манипулировать экзосомальных пути торговли будут полезны в технике новых ингибиторов секреции exNef. Ингибирования секреции exNef должна уменьшать CD4 Т-лимфоцитови ЦРУ, что диск с ВИЧ / СПИДом патогенез.

Чтобы собрать доказательства того, что привело к нашей модели по профилактике ВИЧ / СПИД прогрессирования заболевания и последующие данные, которые построены на этой модели, мы разработали ряд новых реагентов и методик, которые позволили нам проанализировать генетику exNef секреции, и начинают определять клеточные белки участвуют. В начальной работы, мы обнаружили, что Nef белок индуцирует апоптоз в клетках наблюдателем и освобождается от внеклеточно Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки ^15. Пептиды, полученные из SDF-1α (стромальных клеток, полученных Фактор-1, с альтернативными альфа сплайсинг) было показано ранее, сохранить большую часть обязательных и сигнальную активность полноразмерной молекулы ^17. Мы предположили, что пептиды Nef может сохранить некоторые апоптотической активности полный белок, и что эти пептиды обязательно содержать Nef апоптоза домена (ов). Чтобы определить эти пептиды, и, следовательно, Нефапоптоза домен (ы), мы получили набор из 20 ВИЧ-1 Неф сканирования пептидов из NIH исследований СПИДа и программы Ссылки реагента. Эти 20-ак пептидов, каждое перекрытие 10 аминокислот его сосед, именуются по числу их последней аминокислоты, то есть N20 пролетов Nef аминокислот 1-20, N30 пролетов Nef аминокислоты 11-30, и т.д. ^16. Мы обнаружили, что воздействие на Т-клетки внеклеточного со специфическими пептидами перекрытия двух различных 10-AA доменов в полнометражном Nef белок индуцирует апоптоз в этих клетках. Последующий анализ этих Nef-производных пептидов апоптоза показало их способность физически взаимодействовать с рецептором хемокинов CXCR4 на поверхности Т-клетки, с кинетику связывания, которые позволили эти пептиды конкурентно ингибировать связывание между CXCR4 и его природным лигандом SDF-1α. Наконец, взаимодействие Nef полученных апоптоза пептидов с CXCR4 был найден, чтобы вызвать стрессовую реакцию в этих Т-клеток приводит к апоптозу. Эти данные позволили нам QUICKly карту Неф в функциональных областей; процесс, который был бы гораздо больше времени с использованием стандартных ДНК мутагенных методы, такие как аланин сканирующий мутагенез. Он также показал, что эти короткие Nef-пептидов сохранили биологическую функцию апоптоза доменов в полноразмерного белка.

Выявив роль внеклеточной Неф, т.е. апоптоз Т-клеток, мы стремились лучше понять, как Неф был секретируется клетками. Используя серию мутировал конструкций Неф, мы сопоставили высоко консервативных мотивов Nef белка в N-концевых участков как ВИЧ, так Неф, и его макаки резус эквивалентной SIV _Mac ​​(Simian Вирус иммунодефицита) Неф, которые имеют решающее значение для секреции exNef ^13. Один из этих мотивов, регион секреции Модификация (СМР; 66VGFPV70), было особенно важным, как аланин замены любого из пяти аминокислот, либо значительно сокращены или отменены exNef секреции. Когда доставлены в клетки с помощью C активность мотиваhariot белка поставки реагента, пептид, содержащий SMR прикреплена к последовательности FLAG пептид (SMRwt) было обнаружено, ингибирует секрецию exNef с обеих Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки ^18. На основе нашего предыдущего опыта с пептидами, мы решили использовать этот пептид выяснить молекул и механизмов, лежащих в основе роли Nef SMR в секреции exNef.

Использование SMRwt пептида, как наш "приманки белка», мы совместно иммунопреципитировало сотовой связывающих партнеров МСП из неинфицированных Т-клеточных лизатов ^18. Последовательность пептида FLAG предоставил удобную ручку для захвата SMRwt пептида с использованием анти-FLAG смоле. Наш предыдущий вывод, что один валин на аланин в пептидной SMRwt было достаточно для его отмене ингибирования секреции exNef определили удобно, весьма специфический контрольный пептид (SMRmut), которые мы использовали, чтобы исключить совместное иммуноосажденного белки не специфичны для SMR. Использование пептид с секpecific область интересов, а не полноразмерного белка позволило нам обойти скрининг десятков клеточных факторов, которые связываются с другими доменами в Неф ^19.

Как только мы определили SMR-связывающих партнеров, следующим логическим шагом было показать, что выявленные сотовой связывающие партнеры важны для биологической функции ^18. Стандартной процедурой для достижения этой цели является нокдаун белка использованием белок-мишень конкретных микроРНК или миРНК, а впоследствии анализ влияния на биологические функции. Мы провели микроРНК нокдаун, которое ингибирует трансляцию мРНК-мишени, снижение производства этой цели, в данном случае SMR-связывающий белок. Это уменьшение целевого белка косвенное воздействие, и, возможно, имеет задержку влияние на биологическую функцию целевой белок играет роль дюйма Следовательно, мы также использовали менее распространенный метод ингибирование антителами, чтобы определить, непосредственно нарушения деятельностицелевого белка уменьшает или устраняет биологической функции. В этой процедуре антител, полученных против белка-мишени трансфицируют в клетку использованием Колесница реагентов и взаимодействуют непосредственно с белком-мишенью, либо изолирующий его от места его функции или блокирования его соответствующим связывающим доменом. Ингибирование целевого белка через эту процедуру непосредственно нарушает его функции, и могут дополнять процедуры нокдауна РНК дальнейшим что подтверждает важность целевого белка в биологической функции.

В то время как Колесница реагент является эффективным при доставке пептидов и белков в клетки, этот процесс занимает много времени и ограничивает типа экспериментов, например продолжительного или повторяющегося воздействия и в естественных условиях исследования на животных, которые могут быть выполнены. Следовательно, мы добавили клеточной проникающих пептидов (CPP) последовательность SMRwt пептид (SMRwt-CPP) ^{18, генерируя} пептид, который может быть воспринята клеткой пассивноиз культуральной среды. Эта версия была так эффективна, как бывший в подавлении секреции exNef.

Данные, полученные в этих опубликованных экспериментов демонстрируют способность небольшие пептиды, содержащие специфические функциональные мотивы противодействовать функцию полноразмерного белка посредством конкурентного ингибирования, и изолировать белками, которые связывают эти мотивы. Можно было бы ожидать, что эти методы должны быть полезны во многих экспериментальных протоколов. Они также должны быть эффективными в инженерных романа пептидные ингибиторы многих клеточных процессах; функция, которая может быть расширена путем связывания с CPP последовательностей.