זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד
Summary
טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.
Abstract
פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, במקרה שלנו ה-HIV-1 NEF, לא רק שומרים על התפקוד הביולוגי שלהם, אלא גם יכולים לעכב את הפונקציה של החלבון באורך מלא באופן תחרותי. קבוצה של 20 פפטידים סריקת NEF, 20 חומצות אמינו באריכות עם כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, שתשמש לזיהוי מוטיבים בהנף אחראי לגרימת מות תאים מתוכנת שלה. פפטידים המכילים מוטיבים אפופטוטיים אלה מושרה אפופטוזיס ברמות דומות לחלבון הנף באורך מלא. הפפטיד שני, הנגזר משינוי אזור ההפרשה (SMR) של NEF, נשמרים היכולת ליצור אינטראקציה עם חלבונים תאיים המעורבים בהפרשה של הנף בexosomes (exNef). פפטיד SMRwt זה שימש כחלבון "הפיתיון" בשיתוף immunoprecipitation ניסויים כדי לבודד חלבונים תאיים הנקשרים באופן ספציפי למוטיב SMR של NEF. עיכוב transfection ונוגדן חלבון שימש לשבש את הימור האינטראקציה פיזיWeen הנף וmortalin, אחד מחלבוני SMR מחייבים המבודדים, ואת ההשפעה נמדד עם assay הפרשת exNef מבוסס פלורסנט. יכולתו של פפטיד SMRwt לגבור הנף באורך מלא לחלבונים תאיים הקושרים את מוטיב SMR, להפוך אותו למעכב הראשון של הפרשת exNef. וכך, על ידי שימוש בטכניקות שתוארו כאן, אשר מנצלים את התכונות הייחודיות של פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, ניתן להאיץ את זיהוי של מוטיבים פונקציונליים בחלבונים ופיתוח של מעכבים של פונקציות פתוגניים המבוססים על פפטיד.
Introduction
עם כניסתו של טיפול אנטי retroviral, מגיפת האיידס בעולם המערבי כבר האט, אבל לא קוצץ, ואת התפשטות האיידס ממשיכה להיות נטל בריאות גדול ברחבי העולם. למעט שולי האפקטיבי המשפט התאילנדי RV144, חיסונים נגד איידס הראו כישלון בהגנה מפני זיהום עד כה. לכן, מחקר לתוך מטרות נוספות, פוטנציאל טיפולי עדיין מוצדק.
יחד עם CD4 דלדול תאי T, הפעלה חיסונית כללית מתמשכת היא סימן היכר של ההידבקות ב-HIV. הפעלה חיסונית כרונית (CIA) מובילה לעלייה במחזור תא, subpopulations ימפוציטית הופעל ומובחן, תשישות והזדקנות תאית, והרג של תאי T ותאי B באמצעות הפעלה-induced מוות של תאים (AICD) 1,2,3, ו היא מבוססת היטב כאחד מהמנבאים החזקים של התקדמות מחלה 4,5,6,7,8,9,10,11,12. עם זאת, המנגנונים שבבסיס ה-CIA וCD4דלדול בהידבקות ב-HIV תא T להישאר להיות הובהר באופן מלא.
ראיות מהמעבדה ואחרים שלנו הובילו אותנו למודל להתקדמות מחלה (איור 1) שבו חלבון ה-HIV הניפו (פקטור רגולציה שלילי) גורם להפרשתו בexosomes מHIV-1 תאים נגועים 13,14. exosomes המכיל הנף אלה (exNef) לגרום לאפופטוזיס במספר שושלות תאי CD4 כולל נגוע T-תאי 15,16. לחלופין, במונוציטים / מקרופגים דפוסי שינה exNef ביטוי גנים, ביטוי למשל ציטוקינים, ונראה לגרום למצב של הפעלה חיסונית לא מתוכננת. גוף זה של ראיות מצביע על תפקיד חשוב עבור exNef ב- CIA ודלדול CD4 T-תאים.
הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול תאי T מסוג CD4וה-CIA שפתוגנזה כונן ה-HIV / איידס.
כדי לאסוף ראיות שהובילו למודל שלנו להתקדמות המחלה HIV / איידס ואת הנתונים הבאים שנבנו על מודל זה, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה של הפרשת exNef, ולהתחיל לקבוע את חלבונים תאיים מעורבים. בעבודה הראשונית, מצאנו כי החלבון הנף גורם לאפופטוזיס בתאים עוברים אורח והוא שוחרר מתאי extracellularly הנף-transfected ונגועים באיידס 15. פפטידים הנגזרים מ( תא סטרומה נגזר Factor-1, עם אלפא שחבור החלופי) SDF-1α כבר הראו בעבר כדי לשמור על חלק גדול מהפעילות המחייבת ואיתות של המולקולה באורך מלא 17. אנו משערים כי פפטידים של הנף אולי לשמר חלק מהפעילות אפופטוטיים של חלבון המלא, וכי הפפטידים האלה בהכרח יכילו תחום אפופטוטיים הנף (ים). לזהות פפטידים אלה, וכתוצאה מכך הנףתחום אפופטוטיים (ים), השגנו קבוצה של 20 HIV-1 פפטידים סריקה 'קערה ממחקר NIH האיידס ומגיב תכנית הפניה. פפטידים 20-AA אלה, כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, נקראים במספר חומצות אמינו האחרונה שלהם, כלומר N20 משתרע 'קערה 1-20 חומצות אמינו, חומצות N30 משתרע 11-30' קערת אמינו, וכו '16. מצאנו כי חשיפת תאי T extracellularly לפפטידים ספציפיים חופפים שני תחומים 10-AA שונים באפופטוזיס המושרה החלבון הנף באורך מלא בתאים אלה. ניתוח בדיעבד של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו אלה חשף את היכולת שלהם אינטראקציה פיזית עם קולט chemokine CXCR4 על פני השטח של תאי T, עם קינטיקה מחייבת שאפשרה פפטידים אלה כדי לעכב מחייבים תחרותיים בין CXCR4 ויגנד הטבעי שלו SDF-1α. לבסוף, האינטראקציה של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו עם CXCR4 נמצאה כדי לגרום תגובת לחץ בתאי T אלה מובילים לאפופטוזיס. עדות זו אפשרה לנו quicתחומים הפונקציונליים של קלי המפה 'הקערה; תהליך זה היה לוקח הרבה יותר זמן שימוש בטכניקות סטנדרטיות מוטגניות DNA כגון mutagenesis סריקת אלאנין. הוא גם הראה שפפטידים שמקורם בהנף קצרים אלה נשמרים הפונקציה הביולוגית של הדומיינים אפופטוטיים בחלבון באורך מלא.
לאחר שזיהיתי את תפקיד להנף תאי, כלומר אפופטוזיס של תאי T, בקשנו הבנה טובה יותר של איך הנף היה מופרש מהתאים. באמצעות סדרה של מבני 'קערה עברו מוטציה, מיפינו את מוטיבים חלבון' קערה שמורה באבולוציה באזורי N-המסוף של שניהם HIV NEF, ו מק (וירוס כשל חיסוני קופי) הנף רזוס מקוק מקביל SIV, שהם קריטיים לexNef הפרשה 13. אחד מהמוטיבים האלה, אזור שינוי ההפרשה (SMR; 66VGFPV70), היה קריטי במיוחד, כתחליף אלאנין של כל אחד מחמש חומצות אמינו גם קטינה באופן משמעותי או יבוטל הפרשת exNef. כאשר נמסרו לתאים באמצעות C של המוטיב פעילhariot המשלוח מגיב חלבון, פפטיד המכיל SMR מצורף רצף פפטיד דגל (SMRwt) נמצא לעכב את הפרשת exNef משני תאים הניפו-transfected ונגוע באיידס 18. בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו עם פפטידים, החלטנו להשתמש בפפטיד זה כדי להבהיר את המולקולות ומנגנונים העומדים בבסיס תפקידו של הנף SMR בהפרשת exNef.
שימוש בפפטיד SMRwt כמו "חלבון הפיתיון" שלנו, אנחנו שותפים מחייבים הסלולר של SMR במשותף immunoprecipitated מlysates תא T נגוע 18. רצף פפטיד הדגל סיפק ידית נוחה ללכידת פפטיד SMRwt באמצעות שרף זיקה אנטי דגל. הממצא הקודם שלנו שואלין יחיד לאלאנין מוטציה בפפטיד SMRwt היה מספיק לביטול העיכוב של הפרשת exNef זיהה, פפטיד ספציפי מאוד שליטה נוחה (SMRmut) שהשתמשנו בו כדי לשלול חלבוני שיתוף immunoprecipitated לא ספציפיים לSMR. שימוש בפפטיד עם יםתחום pecific של עניין ולא לחלבון באורך מלא אפשר לנו לעקוף את הסינון של עשרות גורמים הסלולר אשר נקלטות על תחומים אחרים בהנף 19.
ברגע שזיהינו את השותפים SMR-מחייבים, צעד הגיוני הבא היה להראות כי בני הזוג שזוהה סלולארי הכריכה הם חשובים לתפקוד הביולוגי 18. ההליך הרגיל כדי להשיג את זה הוא באמצעות מציאה רמות חלבון מירנה יעד חלבון ספציפית או siRNA, ולאחר מכן assay ההשפעה על התפקוד הביולוגי. בצענו מציאה מירנה, אשר מעכבת תרגום של mRNA היעד, צמצום ייצור של יעד זה, במקרה זה חלבון SMR מחייב. הפחתה זו של חלבון המטרה היא השפעה עקיפה, ואולי יש לו השפעה מאוחרת על הפונקציה הביולוגית ממוקד החלבון ממלא תפקיד בו כתוצאה מכך, אנחנו גם עובדים בטכניקת עיכוב הנוגדן פחות הנפוצה כדי לקבוע אם ישירות לשבש את פעילותו שלחלבון המטרה מפחית או מבטל את הפונקציה הביולוגית. בהליך זה, נוגדנים שהועלו נגד החלבון ממוקד הם transfected לתוך התא באמצעות מגיב מרכבה, ולתקשר ישירות עם חלבון המטרה או sequestering אותו מהאתר שלה של פונקציה, או חסימת תחום המחייב הרלוונטי שלה. עיכוב של חלבון המטרה באמצעות הליך זה משבש את תפקודו באופן ישיר, ויכול להשלים את הליכי מציאה RNA על ידי המאשר את חשיבותו של חלבון המטרה נוסף לפונקציה הביולוגית.
אמנם מגיב מרכבה הוא יעיל במתן פפטידים וחלבונים לתאים; תהליך זה הוא זמן רב ומגביל את סוגי ניסויים, למשל חשיפות ממושכות או חוזרות ונשנות, ובמחקרים בבעלי החיים vivo ניתן לבצע את זה. כתוצאה מכך, הוספנו פפטיד רצף תא חודר (CPP) לפפטיד SMRwt (SMRwt-CPP) 18 ליצירת פפטיד שיכול להילקח על ידי תאים פסיבייםמתקשורת והתרבות. גרסה זו הייתה יעילה כמו לשעבר בהפרשת exNef עיכוב.
העדויות מניסויים שפורסמו אלה מדגימה את היכולת של פפטידים קטנים המכילים מוטיבים פונקציונליים ספציפיים כדי להרגיז את הפונקציה של החלבון באורך מלא באמצעות עיכוב תחרותי, וכדי לבודד את החלבונים הנקשרים מוטיבים אלה. ניתן היה לצפות כי טכניקות אלה צריכים להיות שימושיות בהרבה פרוטוקולי ניסוי. הם צריכים גם להיות יעילים במעכבי פפטיד חדשניים הנדסיים של תהליכים תאיים רבים, פונקציה שניתן לשפר עוד יותר על ידי הצמדה לרצפי CPP.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול CD4 תא T וה-CIA שכונן ה-HIV / איידס פתוגנזה. למען מטרה זו, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIGMS / MBRS (58,268 גרנט), NIH / NCRR / RCMI (גרנט G12-RR03034), מחקר גאורגיה לברית מימון מענק GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA מענק F31AI091484, אמורי CFAR מענק P30 A1050409. חקירה זו נערכה במתקן בנוי עם תמיכה ממחקר שיפור מתקני גרנט # C06 RR18386 מNIH / NCRR. תאי Jurkat, הקבוצה של 20 HIV-1 פפטידים NEF, כמו גם הארנב נגד HIV-1 הנף נסיוב התקבל מ-NIH איידס המחקר והתכנית מגיב הפניה (רוקוויל, מרילנד).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen?. Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef’s interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
