機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

抗レトロウイルス療法の出現により、西部の世界のエイズ流行は鈍化したが、縮小しない、そしてHIVの蔓延は、世界中の主要な健康上の負担であり続けてきた。わずかに効果的なRV144タイ裁判を除いて、HIVワクチンは、これまで感染から守るための失敗を示している。したがって、追加の、潜在的な治療標的の研究はまだ保証されています。

CD4 T細胞枯渇とともに、永続的な一般的な免疫活性化は、HIV感染症の特徴です。この慢性的な免疫活性化（CIA）は、細胞の代謝回転、活性化され、差別化リンパ球亜集団、細胞の枯渇や老化、及び活性化誘導細胞死^{（AICD）1,2,3}を経由してT細胞とB細胞の殺害の増加につながり、それはよく病気の進行^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}最強の予測因子の一つとして確立されています。しかし、メカニズムはCIAとCD4の基礎となるHIV感染T細胞枯渇は完全に解明されていない。

私たちの研究室や他の人からの証拠は、HIVタンパク質ネフは（負の調節因子）HIV-1感染細胞^13,14からエキソソームでその分泌を誘導する前記疾患の進行のためのモデル（ 図1）に私たちを導いた。これらネフ含有エキソソーム（exNef）が感染していないCD4 T細胞^15,16を含む細胞系統数のアポトーシスを誘導する。あるいは、単球/マクロファージexNefを変化させる遺伝子の発現パターン、 例えば、サイトカイン発現、およびスケジュールされていない免疫活性化状態を誘導すると思われる。証拠のこのボディは、CIAとCD4 T細胞枯渇exNefための重要な役割を示唆している。

エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇を減少させるべきであるそしてCIAそのドライブHIV / AIDS発病。

HIV / AIDS疾患の進行と、このモデルの上に構築され、その後のデータのための我々のモデルにつながった証拠を集めるために、私たちは私たちがexNef分泌の遺伝学を分析するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発し、決定するために開始細胞タンパク質が関与。初期の研究では、Nefのタンパク質が、バイスタンダー細胞のアポトーシスを誘導し、Nefのトランスフェクトし、HIV感染細胞から細胞外に^15を解放していることがわかった。 SDF-1α由来のペプチドは、（選択的スプライシングアルファ因子-1由来間質細胞、）以前に、完全長分子¹⁷の結合およびシグナル伝達活性の多くを保持することが示されていた。我々はNefとのペプチドは、完全なタンパク質のアポトーシス活性の一部、及びこれらのペプチドは、必ずしもNefのアポトーシスのドメインを含むであろうことを保持するかもしれないと推測した。これらのペプチドを同定し、その結果のNefするにはアポトーシスドメイン（s）は、私たちは、NIH AIDS研究およびリファレンス試薬プログラムからの20 HIV-1 Nefのスキャニングペプチドのセットを取得しました。これらの20-AAペプチド、その隣人の各重複10アミノ酸は、彼らの最後のアミノ酸、 すなわち N20スパンネフアミノ酸1-20、N30スパンネフアミノ酸11-30、など¹⁶の数で名前が付けられています。我々は、これらの細胞のアポトーシスを誘導したフルレングスのNefタンパク質に二つの異なる10-AAドメインを重複特定のペプチドに細胞外にT細胞を露出することがわかった。これらネフ由来アポトーシスペプチドのその後の分析は、物理的にこれらのペプチドが競争CXCR4とその天然のリガンドがSDF-1αの間の結合を阻害するために許可された結合動態とT細胞の表面上のケモカイン受容体CXCR4と相互作用する能力を明らかにした。最後に、CXCR4とNefのアポトーシス誘導ペプチド '相互作用は、アポトーシスをもたらすこれらのT-細胞におけるストレス応答を誘導することが見出された。この証拠はQUICに私たちを許さKLYマップネフの機能ドメイン、例えばアラニンスキャニング変異誘発のような標準的なDNA変異誘発技術を使用して、はるかに長い時間かかったでしょうプロセス。また、これらの短いNefの由来ペプチドは、全長タンパク質におけるアポトーシスドメインの生物学的機能を保持することを示した。

外ネフ、T細胞、すなわちアポトーシスの役割を同定したので、私たちは、ネフは細胞から分泌されたかの理解を求めた。変異ネフコンストラクトのシリーズを使用して、我々は、HIV Nefの両方のN末端 ​​領域で高度に保存されたのNefタンパク質モチーフにマッピングされ、exNef分泌¹³のために重要であるそのアカゲザル同等SIV _マック （サル免疫不全ウイルス）ネフ、。これらのモチーフの一つで、分泌の変更地域（SMR、66VGFPV70）は、どちらか大幅に削減または廃止exNef分泌その5つのアミノ酸のうちのいずれかのアラニン置換として、特に重要でした。アクティブなモチーフのCを介して細胞に送達する場合hariotタンパク質デリバリー試薬、FLAGペプチド配列（SMRwt）に取り付けられたSMRを含むペプチドは、両方のNefのトランスフェクトし、HIV感染細胞¹⁸からexNef分泌を阻害することが見出された。ペプチドと私たちのこれまでの経験に基づいて、我々は、分子やexNef分泌のネフSMRの役割のメカニズムを解明するために、このペプチドを使用することを決めた。

私達の"baitタンパク質"としてSMRwtペプチドを使用して、我々は非感染T細胞溶解物¹⁸からSMRの細胞結合パートナーを共同免疫沈降。 FLAGペプチド配列は、抗FLAGアフィニティー樹脂を用いSMRwtペプチドを捕捉するための便利なハンドルを提供した。 SMRwtペプチドの変異をアラニンに単一のバリンがexNef分泌の阻害を廃止するために十分であることが我々の以前の発見は、私たちがSMRに特異的ではないの共免疫沈降したタンパク質を排除するために使用する便利な、非常に特異的なコントロールペプチド（SMRmut）を同定した。 sのペプチドを用いpecific興味のあるドメインではなく、全長タンパク質は、私たちは、ネフ¹⁹内の他のドメインに結合する細胞因子の数十のスクリーニングをバイパスすることができました。

かつて我々はSMR-結合パートナーを同定し、論理的な次のステップは、同定された細胞の結合パートナーは、生物学的機能¹⁸のために重要であることを示すことだった。これを実現するための標準的な手順は、標的タンパク質に特異的なmiRNA又はsiRNA、および生物学的機能に続いてアッセイを用いてノックダウン効果のタンパク質レベルである。我々は、この場合には、SMR結合タンパク質をそのターゲットの産生を減少させる、標的mRNAの翻訳を阻害する、miRNAのノックダウンを行う。標的タンパク質のこの減少は、間接的な効果であり、おそらく標的タンパク質が入っ従って、我々はまた、活性を直接破壊することかどうかを判断するために、あまり一般的抗体阻害技術を用い役割を果たしている生物学的機能で遅延効果を有する標的タンパク質は、生物学的機能を低減または排除する。この手順では、標的タンパク質に対して惹起された抗体は、戦車試薬を用いて細胞にトランスフェクトされ、その関数のサイトから標的タンパク質と直接相互作用のいずれか封鎖、またはその関連結合ドメインを遮断する。この手順を介して標的タンパク質の阻害は、直接その機能を破壊し、さらに生物学的機能に標的タンパク質の重要性を確認することにより、RNAのノックダウン手順を補完することができる。

戦車試薬は、細胞にペプチドおよびタンパク質を送達するのに有効であるが、このプロセスは時間がかかると、実験の種類を制限するなどの長時間または繰り返し暴露およびインビボ動物試験で行うことができる。したがって、我々は、受動的に細胞に取り込まれる可能性ペプチドを生成するためにSMRwtペプチド^{（CPP-SMRwt）18}細胞透過性ペプチド（CPP）シーケンスを添加培地から。このバージョンでは、阻害exNef分泌の元と同じくらい効果的であった。

これらの公表の実験から得られた証拠は、競争力の阻害を介して、全長タンパク質の機能に拮抗し、これらのモチーフを結合するタンパク質を分離するために、特定の機能的なモチーフを含む小さなペプチドの能力を示しています。一つは、これらの技術は、多くの実験プロトコルに有用であることを期待する。また、多くの細胞プロセスの工学新規なペプチド阻害するのに有効であるべきである。CPPの配列への結合によってさらに向上させることができる機能。