Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik
Summary
Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.
Abstract
Bizim örneğimizde, HIV-1 Nef, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptitler, bunların biyolojik fonksiyonu muhafaza, aynı zamanda rekabetçi tam uzunluktaki protein fonksiyonunu inhibe değil sadece. 20 Nef tarama peptidler, her biri komşu 10 amino asit uzunluğunda ve üst üste gelen 20 amino asit, bir dizi apoptoz, endüksiyon sorumlu NEF motifleri tanımlamak için kullanıldı. Bu apoptotik motifleri içeren peptidler, tam uzunluktaki Nef proteini ile karşılaştırılabilir düzeyde apoptoza neden olmuştur. Nef en salgılanması Değişiklik Bölgesi (SMR) elde edilen ikinci bir peptid, exosomes yılında Nef en salgı (exNef) dahil hücresel proteinlerle etkileşim yeteneği korudu. Bu SMRwt peptid Nef, en SMR motifi özellikle bağlanan hücresel proteinlerin izole edilmesi için ko-immünopresipitasyon deneylerde "yem" bir protein olarak kullanılmıştır. Protein transfeksiyon ve antikor inhibe fiziksel etkileşimi bahsi bozmak için kullanılanween Nef ve mortalin, izole edilmiş SMR bağlayıcı proteinlerin biri, ve bu etki, bir floresan bazlı exNef salgılama tahlili ile ölçüldü. SMR motifi bağlanan hücresel protein için tam uzunlukta Nef outcompete SMRwt peptid yeteneği, bu exNef salgılanması ilk inhibitörünün etkisi. Bu nedenle, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptidlerin eşsiz özelliklerini kullanan burada tarif edilen teknikler kullanılarak, tek bir protein işlevsel motiflerin belirlenmesi ve patojenik fonksiyonları peptit bazlı inhibitörlerinin geliştirilmesi hızlandırabilir.
Introduction
Antiretroviral tedavi ile birlikte, batı dünyasında AIDS salgını yavaşladı, ama kısıtlandığını değil, ve HIV yayılmasını dünya çapında önemli bir sağlık yük olmaya devam edilmiştir. Marjinal etkili RV144 Tay deneme dışında, HIV aşı bugüne kadar enfeksiyondan korumak için başarısızlık göstermiştir. Böylece, ek, potansiyel terapötik hedefler araştırma hala garanti edilir.
CD4 T hücre tükenmesi ile birlikte, kalıcı genel immün aktivasyon HIV enfeksiyonunun bir özelliğidir. Bu Kronik Bağışıklık Aktivasyon (CIA) hücre yenilenmesini, aktif ve ayırt lenfositik alt popülasyonlar, hücresel yorgunluk ve yaşlanma ve Aktivasyon Bağlı Hücre Ölümü (AICD) 1,2,3 ile T hücreleri ve B hücrelerinin öldürülmesi artar yol açar ve iyi hastalığın ilerlemesi 4,5,6,7,8,9,10,11,12 en güçlü belirleyicileri biri olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, mekanizma CIA ve CD4 yatanHIV enfeksiyonunda tükenmesi T-hücresi tam olarak aydınlatılmış kalır.
Bizim laboratuvar ve diğerlerinden kanıt HIV protein Nef (Negatif Düzenleme Faktörü) HIV-1 ile infekte hücreleri 13,14 den exosomes kendi salgı neden neyin hastalığın ilerlemesi için bir model (Şekil 1) götürdü. Bu Nef-içeren exosomes (exNef) enfekte CD4 + T-hücreleri de dahil olmak üzere 15,16 hücre soylarının bir dizi apoptoza neden olur. Alternatif olarak, monositlerde / makrofajlar exNef değiştiren gen ekspresyonu, örneğin sitokin ifade ve programsız immün aktivasyon bir devlet neden görünüyor. Bu delil vücut CIA ve CD4 T hücre tükenmesi exNef için önemli bir rol göstermektedir.
Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 + T-hücre deplesyonu düşecektirve CIA sürücü HIV / AIDS patogenezinde bu.
HIV / AIDS hastalığın ilerlemesi ve bu model üzerine inşa sonraki veri için bizim modeli neden kanıt toplamak için, bize exNef salgılanması genetik analiz için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir ve belirlemek başlar hücresel protein çıkıyor. İlk çalışmada, Nef proteini bekleme hücrelerde apoptozu indükler ve Nef-transfekte edilmiş ve HIV bulaşmış hücrelerden hücre dışında 15 serbest olduğu bulundu. SDF-1α (alternatif yapıştırma alfa faktörü-1 kaynaklı stromal hücre) türetilen peptitler daha önce çok tam uzunluktaki molekülün 17 bağlayıcı ve sinyal aktivitesi korudukları gösterilmiştir edilmiştir. Biz Nef peptidler tam protein apoptotik aktivite bazıları ve bu peptidler mutlaka Nef apoptotik alanı (ler) içeren olacağını korumak yönünde söylentiler. Bu peptidlerin tespit ve dolayısıyla Nefapoptotik etki (ler), böylece NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı 20, HIV-1 Nef tarama peptidler bir dizi elde edilmiştir. Bu 20-AA peptitler, komşu 10 amino asit üst üste binen her biri, son amino asidi, yani, N20 açıklıklı Nef, amino asitler 1-20, N30 açıklıklı Nef, amino asitler 11-30, vb 16 sayısına göre adlandırılır. Bu hücrelerdeki tam uzunluktaki Nef proteini apoptosis, iki ayrı 10-AA etki çakışan peptidlere özgü T-hücrelerinin, hücre dışında açığa bulundu. Bu Nef-apoptotik türetilmiş peptidlerin sonraki analiz fiziksel olarak bu peptidlerin rekabetçi CXCR4 ve doğal ligandı SDF-1α arasındaki bağlanmayı inhibe izin bağlanma kinetiği ile T-hücrelerinin yüzeyi üzerinde kemokin reseptörü CXCR4 ile etkileşme kabiliyeti olduğu ortaya çıkmıştır. Son olarak, CXCR4 ile Nef-apoptotik türetilen peptidleri 'etkileşimi apoptoza yol açan, bu T-hücrelerinde, bir stres yanıtı neden olduğu bulunmuştur. Bu kanıt bize quic izinkıy haritası Nef fonksiyonel etki, bu tür alanin tarama mutagenez gibi standart DNA mutajenik teknikleri kullanılarak çok daha uzun almış bir süreç. Ayrıca, bu kısa bir Nef-türevli peptitler, tam uzunluktaki protein ile apoptotik etki biyolojik fonksiyonu muhafaza ettiğini gösterdi.
Nef, hücre dışı bir rolü tespit ettikten sonra, T-hücrelerinin, yani, apoptoz, böylece Nef hücrelerinden salgılanan ne kadar daha iyi bir anlayış aranır. Nef, mutasyona uğramış yapıların bir dizi kullanarak, HIV Nef, hem N-terminal bölgelerinde yüksek ölçüde korunmuş Nef proteini motifleri eşlenir ve exNef salgılanması 13 için kritik olan Rhesus macaque eşdeğer SIV Mac (Maymun bağışıklık eksikliği Virüsü) Nef,. Bu motiflerinden biri, Salgı Değişiklik Bölgesi (SMR, 66VGFPV70), beş amino asitlerin herhangi birini büyük ölçüde exNef salgısı azaltılması veya tamamen kaldırılması bir alanin yerine, özellikle kritik oldu. Aktif Motif C üzerinden hücrelerine verildiği zamanhariot proteini dağıtım reaktifi, bir FLAG peptid dizisi (SMRwt) bağlı olan bir peptid ihtiva eden SMR 18 hücre Nef-transfekte edilmiş ve HIV ile enfekte hem de exNef sekresyonunu inhibe ettiği bulunmuştur. Peptidler ile önceki deneyimlere dayanarak, biz moleküller ve exNef salgılanması Nef SMR rolü altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için bu peptid kullanmaya karar verdi.
Bizim "yem protein" olarak SMRwt peptid kullanarak, enfekte edilmemiş T hücre lizatları 18 SMR hücresel bağlama ortakları co-immünopresipitasyon. FLAG peptid dizisi Anti-Flag afinite reçinesi kullanılarak SMRwt peptid yakalamak için uygun bir sap sağladı. SMRwt peptid mutasyon alanin tek bir valin exNef salgısının inhibisyonu kaldırılması için yeterli olduğunu daha önceki bulgu biz SMR için özel olmayan eş immunoprecipitated proteinler ekarte etmek için kullanılan uygun, son derece özel kontrol peptid (SMRmut) tespit. S sahip olan bir peptit kullanılarakyerine tam uzunluktaki protein daha ilgi çekici pecific etki bize Nef 19 diğer etki bağlanan hücresel faktörleri onlarca tarama geçebileceğinden.
Bir kez bir sonraki mantıklı adım tespit hücresel bağlama ortakları biyolojik fonksiyonu 18 için önemli olduğunu göstermekti, SMR-bağlama ortakları tespit. Bunu gerçekleştirmek için standart bir prosedür biyolojik fonksiyonu hedef protein özel miRNA veya siRNA ve daha sonra tahlil etkisini kullanarak demonte protein düzeyleri etmektir. Bu durumda, bir SMR-bağlayıcı protein olarak, bu hedef üretimini azaltarak, hedef mRNA translasyonunu önlerler MiRNA demonte, gerçekleştirilir. Hedef proteinin bu azalma, dolaylı bir etkisi olduğunu, ve muhtemelen de hedeflenen bir proteinin Sonuç olarak içeri bir rol oynayan biyolojik fonksiyonu üzerinde gecikmiş bir etkiye sahiptir, aynı zamanda doğrudan bölgesinin aktivitesini kesintiye olup olmadığını belirlemek için, daha az yaygın antikor engellenmesi tekniği uygulanmıştırHedef proteinin biyolojik fonksiyonu azaltır veya ortadan kaldırır. Bu işlemde, antikorlar, hedeflenen bir proteinin karşı yükseltilmiş Arabası reaktifi kullanarak hücre içine transfekte edildi ve hedef protein işlevi ya da onun sitesinden kenetleme bu, ya da ilgili bağlama alanı bloke ile doğrudan etkileşim vardır. Bu prosedür sayesinde hedef proteinin inhibisyonu doğrudan fonksiyonunu bozan ve daha da biyolojik işlevi olan hedef proteinin önemini teyit RNA demonte işlemleri tamamlayabilir.
Chariot Reaktif hücrelere peptidler ve proteinler teslim etkili iken, bu süreci zaman alıcı ve, deney türleri sınırlar örneğin uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalmaların ve in vivo hayvan çalışmalarında yapılabilir ki. Sonuç olarak, pasif hücreleri tarafından alınabilir bir peptid oluşturmak için SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 bir hücre delici peptid (CPP) dizisi eklendikültür ortamından. Bu sürüm inhibe exNef salgılanması da eski kadar etkili oldu.
Bu yayınlanan deneylerden elde edilen kanıtlar, rekabetçi inhibisyonu yoluyla tam uzunluktaki protein işlevini antagonize etmek için, ve bu motiflerin bağlayan proteinlerin izole edilmesi için özel bir fonksiyonel motifini ihtiva eden küçük peptidlerin yeteneğini göstermektedir. Bir bu teknikler birçok deneysel protokolleri yararlı olması gerektiğini beklenebilir. Ayrıca, birçok hücresel süreçlerin mühendislik yeni peptid inhibitörleri etkili olmalıdır, CPP dizilerine bağ ile daha da arttırılabilir bir işlevi kapsar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 T hücre tükenmesi ve CIA bu sürücü HIV / AIDS patogenezi düşecektir. Bu hedefe doğru, bize exNef salgılanması genetik analiz ve ilgili hücresel proteinleri belirlemek için başlamak için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir. Bu yaklaşım, aynı zamanda doğrudan exNef salgılanması SMR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH / NIGMS / dikdörtgenler (Grant 58268), Ulusal Sağlık Enstitüsü / NCRR / RCMI (Hibe G12-RR03034), Gürcistan Araştırma İttifak finansman hibe GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA hibe F31AI091484, Emory CFAR hibe P30 tarafından desteklenmiştir A1050409. Bu araştırma NIH / NCRR gelen Araştırma Olanakları Geliştirme Hibe # C06 RR18386 desteği ile inşa bir tesis yapılmıştır. Jurkat hücreleri, 20 grubu, HIV-1 Nef peptidler, hem de tavşan anti-HIV-1 Nef antiserumu NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, (Rockville, MD) 'den elde edilmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen?. Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef’s interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
