Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording<em> Xenopus</em> Sinir-kas Co-kültürlerin

1. Ön-deneysel Hazırlama Aşağıdaki çözeltiler (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 1 litre NFR (Normal Kurbağa Ringer), (b) ve 100 ml% 10 salin, (c) ve 100 ml CMF (Ca2 + / Mg2 +-serbest çözelti ), (d) 1 ml ITS (insülin transferin selenyum-, Sigma I1884), (e) ve 100 ml L-15 kültür ortamı, (f) 10 ml HCG (insan koryonik gonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-iç çözüm, çözüm 1 osmotik gücü bir buhar basıncı Osmometer (örn. Wescor model # 5100C) kullanarak yaklaşık 260 mOsm olduğundan emin olmak için kontrol edilmelidir Amfoterisin B (h) 100 ml K +-iç çözüm . (B) çözümleri sterilize filtreleyin ve (c). Solutions (a) (b) ve (c) 4 ° C'de üç aya kadar saklanabilir Bir 25 gauge iğne şırınga ve şırınga filtresi üzerinden liyofilize toz içeren şişe 1 ml deiyonize H2O ilave edilerek çözelti (d) hazırlayın. Bu nihai çözüm cBir 30 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bir kabı veya şişesi tüm bileşenleri bir araya getirerek bir laminer akış kaputu çözeltisi (e) hazırlayın. Nihai çözüm sterilize ve steril santrifüj tüpleri içine 10 ml alikotları aktarmak filtreleyin. -20 ° C'de saklayın 25 gauge şırınga, iğne ve şırınga filtresi ile liyofilize toz içeren flakon H 2 0 deiyonize 10 ml ekleyerek HCG (çözüm (f)) hazırlayın. Bu, nihai çözelti 30 gün boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Tutkallama siyanoakrilat yapıştırıcı ile cam bir Pasteur pipeti ucuna bir Minutien pim (26002-10, İnce Science araçları) ile en az iki mikrodisseksiyon araç imal. Pipet yaklaşık 0.5 cm sonunun uzatmak piminin sivri ucunu ver. Hazırlama kültürleri İki gün önce, aşağıdaki prosedür ile üreme neden. Düzlemsel su üzerinde kadın ve koyu pigmentasyon göze çarpan, kırmızımsı kloaka gözlemleyerek Xenopus bir üreme hazır çifti tanımlayınerkek ön pençeleri rface. Kaçamayacağım böylece bir zaman, net her kurbağa Tek ve net bir lavabo üzerine ventral tarafında basılı tutun. Dorsal lenf keseler net ve deri altından içine biri ile çözeltinin 1 mL'si (f) enjekte edilir. Su ve bir kapalı on galon tank içinde bir arada üreme çifti yerleştirin. Hayvanların yeni koydu ve döllenmiş yumurta trample olmayacak emin olmak için, yaklaşık bir örgü boyutu ½ tankın alt (Şekil 1A) Yukarıdaki "takılı yaklaşık 1-2 inç ekranlı bir zemin yüklemek. Hayvanlar amplexus olan ve döllenmiş yumurta ekranının altındaki kat (Şekil 1B) gözlemlendi kadar 12-48 saat boyunca bozulmadan kurbağaları bırakın. Tankından hayvanlar çıkarın, ama daha uzun en azından 24 saat için yumurta rahatsız bırakın. Kurbağa bu çifti altı hafta sonra yeniden yetiştirilen olabilir. Tankın dibinden embriyolar gevşetin ve dört ya da beş 60X15 mm kült aktarabilirsiniz% 10 tuzlu su (çözüm b) içeren ure yemekleri. Niewkoop ve Faber (ref. 20) şemasına göre evre tarafından embriyolar sıralayın. Faydalı embriyo aşamasında 22-24 az olanlar olacaktır. Şekil 2B (yaklaşık aşamada 28) yararlı olduğu gelişme boyunca çok uzak bir embriyo gösterirken Şekil 2A yaklaşık aşamada 22 embriyo gösterir. Bu sağlıklı embriyolar seçmek önemlidir: açık kahverengi ve beyaz beneklenme ile görünüşte düzgün olanları idealdir. Büyük siyah ya da beyaz lekeler var Embriyolar genellikle sağlıksız ve kullanışsız. 2. Xenopus Embryolarının Mikrodisseksiyon Bir laminer akış kaputu, etiket içinde ve yaklaşık yarım üç 60X15 mm steril kültür% 10 tuzlu yemekleri ile doldurun ve CMF ile bir. % 10 tuzlu su içeren yemekler birine steril, cam Pasteur pipeti transferi 09:55 aşamada 22-24 embriyo kullanma. Bir stereo zoom yardımıyla teşrih ilekaput içinde ing mikroskobu (10 x oküler ile 0.6-5x), steril # 5 forseps (11251-30, Güzel Bilim Araçları) iki çift kullanarak her embriyodan jöle ceket ve vitellin membran kaldırmak. (Şekil 3A ve 3B, bakınız.) % 10 salin kalan iki yemekleri ile ve nihayet CMF içeren yemeğin içine, bir defada bir ileterek çıplak embriyolar yıkayın. Her transfer için yeni bir steril pipet kullanın ve çanak çanak transfer çözeltisinin hacmi en aza indirmek. Buna karşılık, adım 1.5 sitemliyiz mikrodiseksiyon aracını kullanarak, forseps bir çift ile nazikçe ama sıkıca her embriyonun tutun ve nöral tüp ve hayvanın en dorsalinde yer almaktadır ilişkili Miyotom kaldırın. Üç dilim, nöral tüp konumu ve (Şekil 4A) için üçüncü sadece ventral iki ucundan birini yaparak bunu yapın. Uzaklıkta sarısı granül gelen çanak temiz bir parçası her disseke nöral tüp / myotome Taşıes ve diğer enkaz (Şekil 4B). Dorsal-ventral eksen, ve nöral tüp ve miyotomlarında ve konumları Şekil 4 içinde gösterilmektedir. Bu çözüm yaklaşık on beş dakika sonra (CMF) kullanımı forseps disseke doku serbest pigmente deri kaldırın ve atmak. Birbirlerine (Şekil 4C) ayrışmış hale olarak bir ilave 30-60 dakika sonra, hücreler, bir "kum yığını" oluşturacak. 3. Sinir-kas Co-kültürlerin hazırlanması Kültür ortamı bir 10 ml tüp çözülme ve aseptik 70 ul ekleyin ITS ve 35 ng / ml 'BDNF (Sigma B3795). Etiket ve steril 35 mm kültür kaplarına (FD35-100 Dünya Hassas Aletler) yaklaşık yarım L-15 kültür ortamı (çözüm (e)), disseke her bir embriyo için biri ile doldurun. Bir alev üzerinde şevli kısım tutulurken, bir cam Pasteur pipeti her iki ucunda tutarak bir kaplama pipet imal. Yaklaşık 1 ila uçlarında ayrı çek0 cm ve daha sonra yaklaşık 0.2 'lik bir uç elde etmek için son kopar. Çizilmiş çözüm miktarını minimize tek embriyo "kum yığını" yalakalık kaplama pipet kullanın. Bir kültür çanağı alt üzerine hücreleri Expel. Birkaç satır içine Levha hücreleri. Kaplama farklılaşmamış hücreler (Şekil 5A ve 5B) uyun. Hücreler zaman çanak takmak için izin vermek için en az on beş dakika boyunca rahatsız edilmeden kaplı hücreler bulaşık bırakın. 4. Patch Sıkma Sinir-kas Sinapslar Kas hücreleri iğ şeklinde olur ve spinal nöronlar uzun süreçler (Şekil 6) uzatmak: kültüründe 12-24 saat sonra, kaplama hücreleri belirgin morfolojik özellikleri üzerine alır. Nörit varisler ve kas hücreleri arasındaki fonksiyonel sinaptik iletişim simultane eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar ile teyit edilebilir. "M", "S" ve "V" nöronal, kas hücresi sırasıyla bakınsoma ve presinaptik varisler. Presinaptik varisler için ve kas hücresi için bir: Kayıt için iki yama elektrot hazırlayın. Presinaptik elektrot için, aşağıdaki gibi bir amfoterisin B içeren çözeltinin hazırlanması: 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne 100 ul DMSO ekleyin. 10 sn vorteksleyin bu çözüm. Sonraki, Amfoterisin B (çözüm (h)) için +-iç çözüm 625 ul K içeren ikinci bir mikrosantrifüj tüpüne bu çözeltinin 10 ul ekleyin. Yukarıdaki gibi Vortex. Amfoterisin B ihtiva eden K basamak 4.3 'de hazırlanmış +-iç çözelti ile K +-iç çözeltisi (çözeltisi (g)) ile birlikte post-sinaptik elektrot ile pre-sinaptik elektrot doldurun. NFR ile kültür çanak medya değiştirin ve faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop gittiğinizde. Sadece kendi hedeflerinin üzerinde her iki elektrot yerleştirin. Tüm-hücre eş edininvarisler elektrot ile delikli yama yapılandırma önce kas hücresi elektrot ile nfiguration. Sinaps işlevselliğini doğrulamak için, yazılım denetimi altında (örn. Axopatch 200B, Moleküler Cihazlar) bir yama kelepçe amplifikatör ile varisler depolarize (pCLAMP 9, Molecular Devices örneğin) ve eşzamanlı presinaptik ve postsinaptik akımları gözlemlemek. Şekil 7 görülen akımlar gösterilir +40 mV'ye -30 mV 10 mV artışlarla presinaptik varis verilen gerilimi adımlar depolarize yanıt olarak. Presinaptik hücre görülen içe akımları Na + ve Ca 2 + ve K + ile dış akımlar tarafından yürütülmektedir. Postsinaptik akımlar hücre içinde kaydedilmiş varis serbest nörotransmitter yanıtları vardır ve nikotinik asetilkolin reseptörü kanallar vasıtasıyla Na + tarafından çoğunlukla taşınmaktadır.