Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de<em> Xenopus</em> Nervo músculo-Co-culturas

1. Pré-experimental Preparação Preparar as seguintes soluções (ver Tabela 1 para as composições): (a) 1 NFR litro (Ringer-rã normal), (b) 100 ml de solução salina a 10%, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 + solução livre ), (d) 1 ml ITS (insulina-transferrina-selênio, Sigma I1884), (e) 100 ml de meio L-15 de cultura, (f) 10 mL de HCG (gonadotropina coriónica humana Sigma CG-10), (g) 100 ml de K +-solução interna, (h) 100 ml de K +-solução interna para a anfotericina B. A força osmótica de uma solução deve ser verificado para assegurar que é de aproximadamente 260 mOsM utilizando um osmómetro de pressão de vapor (por exemplo, modelo Wescor # 5100C) . Filtrar esterilizar soluções (b) e (c). Soluções (a) (b) e (c) pode ser armazenado até três meses, a 4 ° C. Preparar a solução de (d) por adição de 1 ml de H2O desionizada ao frasco que contém o pó liofilizado por meio de uma agulha de seringa de calibre 25 e seringa de filtro. Esta solução final cum ser armazenado a 4 ° C durante 30 dias. Preparar a solução de (e) numa câmara de fluxo laminar através da combinação de todos os componentes num recipiente ou frasco. Filtrar esterilizar a solução final e transferir alíquotas de 10 ml para tubos de centrífuga estéreis. Armazenar a -20 ° C. Prepare o (solução (f)) HCG pela adição de 10 ml de H 2 0 desionizada ao frasco que contém o pó liofilizado por meio de uma agulha de seringa de calibre 25 e seringa de filtro. Esta solução final pode ser armazenado a 4 ° C durante 30 dias. Fabricar, pelo menos, duas ferramentas de microdissecção colando um pino Minutien (26002-10, Science Tools finas) à extremidade de uma pipeta de Pasteur de vidro com cola de cianoacrilato. Permitir que a extremidade afiada do pino para estender para além da extremidade da pipeta de aproximadamente 0,5 cm. Dois dias antes de preparar culturas, induzir procriação com o seguinte procedimento. Identificar um par de reprodução-pronto de Xenopus, observando uma cloaca, proeminente avermelhada na pigmentação feminino e escuro no su planarrface das patas dianteiras do sexo masculino. Um de um sapo tempo, cada rede e mantê-lo lado ventral para baixo em uma pia com a rede de modo a que não pode fugir. Injectar 1 mL de uma solução de (f) por meio da um líquido e por via subcutânea em dos sacos linfáticos dorsal. Coloque o par reprodutor em conjunto num tanque de galão de água coberta 10. Para assegurar que os animais não pisar os ovos fertilizados e recém-estabelecidas, instalar um piso blindado com um tamanho de malha de cerca de ½ "montados aproximadamente 1-2 polegadas acima do fundo do tanque (Figura 1A). Deixe rãs não perturbadas por 12-48 horas até que os animais estão em amplexo e ovos fertilizados são observados no andar de baixo da tela (Figura 1B). Retire os animais do tanque, mas deixar os ovos em repouso por pelo menos 24 horas por mais tempo. Este par de rãs pode ser re-produzido após seis semanas. Soltar os embriões a partir do fundo do tanque, e transferi-los para quatro ou cinco cult 60×15 milímetrosure pratos contendo solução salina a 10% (solução b). Classificar os embriões por estágio de acordo com o esquema de Niewkoop e Faber (ref. 20). Embriões úteis serão as que estão em fase de 22-24. Figura 2A mostra um embrião em fase de cerca de 22, enquanto a Figura 2B mostra um embrião que está demasiado longe ao longo do desenvolvimento para ser útil (cerca de fase 28). É importante escolher os embriões que são saudáveis: aqueles que são suaves na aparência com manchas castanho claro e branco são ideais. Embriões que têm grandes manchas pretas ou brancas são geralmente insalubre e inutilizável. 2. Microdissecação de embriões de Xenopus Dentro de um fluxo laminar etiqueta capuz, e encher até meio aproximadamente três 60×15 milímetros placas de cultura estéreis com solução salina a 10%, e um com CMF. Usando uma solução estéril, de vidro Pasteur pipeta de transferência de fase 5-10 22-24 embriões em uma das placas contendo solução salina a 10%. Com o auxílio de um zoom estéreo dissecaring microscópio dentro do capô (0,6-5x com 10 x oculares), remova a camada de geléia e membrana vitelina de cada embrião usando dois pares de estéreis # 5 fórceps (11251-30, ferramentas Ciência Belas). (Veja Figuras 3A e 3B). Lavar os embriões nus, passando-os, um de cada vez, através dos restantes dois pratos de solução salina a 10% e, finalmente, para o prato contendo CMF. Usar uma pipeta nova estéril para cada transferência e minimizar o volume de solução transferida de prato para prato. Por sua vez, cada embrião segurar suave mas firmemente, com um par de pinças e, utilizando-se a ferramenta de microdissecção formado no passo 1.5, remover o tubo neural e myotomes associados que estão localizados na parte mais dorsal do animal. Fazer isso através de três fatias, uma em cada extremidade da localização do tubo neural e um terceiro apenas ventral a ele (Figura 4A). Mover cada tubo neural dissecado / myotome a uma parte limpa do prato para longe da granul gemaes e outros detritos (Figura 4B). O eixo dorsal-ventral, e os locais do tubo neural e myotomes são indicados na Figura 4. Após cerca de 15 minutos nesta solução (CMF) fórceps usar para levantar a pele pigmentada livre do tecido dissecado e descartar. Após um adicional de 30-60 minutos, as células formarão uma "pilha de areia", como eles estão dissociados um do outro (Figura 4C). 3. Preparação do nervo músculo-Co-culturas Descongelar um tubo de 10 ml de meio de cultura e adicionar assepticamente 70 uL ITS e 35 ng / ml de BDNF (Sigma B3795). Rótulo e preencher estéreis 35 pratos de cultura (milímetros FD35-100 Precision Instruments Mundo) aproximadamente a meio L-15 com meio de cultura (solução (e)), um para cada embrião dissecados. Fabricar uma pipeta de chapeamento, segurando cada ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro, mantendo a porção afunilada mais de uma chama. Puxe as pontas para além de cerca de 10 cm e, em seguida, se separam ao fim de produzir uma ponta de cerca de 0,2 mm. Utilizar a pipeta de chapeamento para sugar a "pilha de areia" a partir de um embrião de minimizar a quantidade de solução desenhada. Expulsar as células na parte inferior de um prato de cultura. Placa de células em várias linhas. Observar banhados células indiferenciadas (Figura 5A e 5B). Deixe os pratos de células plaqueadas não perturbadas por pelo menos quinze minutos para permitir que o tempo de células para anexar ao prato. 4. Patch clamping nervo-músculo Sinapses Após 12-24 h em cultura, as células banhados a assumir características morfológicas distintas: as células musculares se tornam fusiforme e neurônios espinhais ampliar os processos longos (Figura 6). Contato sináptico funcional entre varicosidades neurite e células musculares pode ser confirmado com simultâneas emparelhados registros eletrofisiológicos. "M", "S" e "V" referem-se, respectivamente, à célula muscular, neuronalsoma e varicosidades pré-sináptica. Preparar dois eléctrodos de patch para gravação: uma para o varicosidade pré-sináptica e um para as células musculares. Para o eléctrodo de pré-sináptica, preparar uma solução de anfotericina contendo o seguinte: Adicionam-se 100 ul de DMSO para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo 5 mg de anfotericina B (Sigma A4888). Vortex esta solução durante 10 seg. Em seguida, adicionam-se 10 ul desta solução para um tubo de microcentrífuga de segundo que contém 625 ul de K +-interno solução de anfotericina B (solução (h)). Vortex como acima. Encher o eléctrodo de pré-sináptica com o K + contendo anfotericina-interno solução preparada no passo 4.3 e o eléctrodo de pós-sináptica com K +-interno solução (solução de (g)). Substituir a mídia na placa de cultura com NFR e realocá-lo em um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase. Posicione os dois eléctrodos apenas acima de suas respectivas metas. Obter o co de células inteirasnfiguration com o eletrodo de célula muscular antes da configuração de patch perfurada com o eletrodo varicosidades. Para confirmar a funcionalidade da sinapse, despolarizar a varicosidade com um amplificador de patch clamp (Axopatch 200B, por exemplo, Molecular Devices), sob o controlo de software (por exemplo, por pCLAMP 9, Molecular Devices) e observar as correntes simultâneas pré-sinápticos e pós-sinápticos. Figura 7 mostra as correntes vistos em resposta aos passos de despolarização de tensão dadas ao varicosidade pré-sináptica em incrementos de 10 mV a partir de -30 mV a +40 mV. As correntes para dentro visto na célula pré-sináptica são transportados por Na + e Ca 2 + e as correntes exteriores por K +. Correntes gravados na célula pós-sináptica são respostas a neurotransmissor libertado do varicosidades e são realizados principalmente por meio de canais de Na + dos receptores nicotínicos da acetilcolina.