からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em>アフリカツメガエル</em>神経筋共培養

1。予備実験の準備 1リットルのNFR（ノーマルカエルリンガー）、（b）は100ミリリットル10％食塩水、（c）は100ミリリットル、CMF（のCa 2 + / Mg 2 +を含まない溶液は、（）：次の解決策を（組成は表1を参照）を準備）、（d）は1ミリリットルのITS（インスリン – トランスフェリン – セレン、シグマI1884）、（e）は100ミリリットルのL-15培地、（f）は、10ミリリットルHCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピンシグマ、CG-10）、（g）は100アムホテリシンBのミリリットルK +内部 ​​溶液、（h）は100ミリリットルK +内部 ​​溶液溶液1の浸透力は、それが蒸気圧浸透圧計（ 例えば Wescorモデル＃5100C）を用いて約260 mOsMであることを保証するためにチェックする必要があります。 （b）のソリューションを殺菌フィルター処理、および（c）。ソリューションズ（a）と（b）と（c）は4℃で3ヶ月まで保存することができます25ゲージの注射針とシリンジフィルターを介して凍結乾燥粉末を含むバイアルに1 ml脱イオンH 2 Oを追加することにより、溶液（d）を準備します。この最終的な解決C30日間4℃で保存すること。 ビーカーやフラスコ内のすべてのコンポーネントを組み合わせることにより、層流フード内の溶液（e）を準備します。最終的な解決策を滅菌し、滅菌遠心管に10ミリリットルのアリコートを転送フィルタします。 -20℃で保存する。 25ゲージの注射針とシリンジフィルターを介して凍結乾燥粉末を含むバイアルにH 2 Oを脱イオン10ミリリットルを添加することによりHCG（溶液（f））を準備します。この最終的な解決策は30日に4℃で保存することができます。 Minutienピン（26002から10、ファイン科学ツール）は、シアノアクリレート接着剤でガラスパスツールピペットの最後に接着することによって、少なくとも2顕微解剖ツールを製作してください。ピペット約0.5cmの末尾を超えて拡張するためにピンの鋭い端を許可します。 二日間の文化を準備する前に、以下の手順で繁殖を誘発する。平面のsuに女性と暗い色素沈着に著名な、赤みを帯びた総排泄腔を観察することにより、 アフリカツメガエルの飼育対応のペアを識別雄の前足のrface。時間、正味各カエルに1つ、それは逃げることができないようにネットでシンクに腹側にそれを押したままにします。背側リンパ嚢の1に皮下ネットと通じ溶液1ml（f）を注入します。 水の覆われた10ガロンタンクで一緒に繁殖のペアを置きます。動物が新たにレイアウトされ、受精卵を踏みつけないようにするため、およそのメッシュサイズ½タンクの底部（ 図1A）上記の"取り付けは約1〜2インチでスクリーニングされた床をインストールしてください。 動物が抱接にあり、受精卵が画面下の床（ 図1B）に観察されるまで、12から48時間静置カエルのままにしておきます。 タンクから動物を削除しますが、長く、少なくとも24時間、卵はそのままにする。カエルのこのペアは、6週間後に再飼育することができます。 タンクの底部から胚を緩めて、4または5 60×15 mmのカルトに転送10％食塩水（溶液B）を含有するURE皿。 Niewkoopとフェーバー（文献20）のスキームに従って段階で胚をソートします。有用胚はステージ22から24でそれらになります。 図2A、図2B（約28段）に有用であることが開発に沿って遠すぎる胚を示しながら、約22段階の胚を示しています。それは健康である胚を選択することが重要です：明るい茶色と白のまだらのある外観が滑らかなものが理想的です。大きな黒または白のパッチが適用されている胚は一般的に不健康と使用できなくなります。 2。 アフリカツメガエル胚の顕微解剖層流フード、ラベル内、10％食塩水で中途半端に約3 60×15ミリメートル無菌培養皿を満たし、およびCMFと1。 10％の食塩水を含んだ料理の一つに、滅菌したガラスパスツールピペット転送五から十段22から24胚を用いた。ステレオズームの助けを借りて解剖するフード内側る顕微鏡（10×接眼レンズ0.6-5X）は、無菌の＃5鉗子（11251から30、ファイン科学ツール）の2ペアを使用して、それぞれの胚からゼリーコートと卵黄膜を除去します。 （ 図3Aおよび図3Bを参照してください。） CMFを含む皿にようやく生理食塩水と10％の残りの2つの料理を通じて、一つずつそれらを渡すことによって、裸の胚を洗浄します。各転送のための新しい、滅菌ピペットを使用し、皿から皿に移し、溶液の体積を最小限に抑えます。 ターンでは、ステップ1.5で作ら顕微解剖ツールを使用して、ピンセットで優しく、しかし、しっかりとそれぞれの胚を保持し、神経管や動物の中で最も背側面に配置されている関連した筋節を削除します。 3スライス、神経管の場所と、それ（ 図4A）にちょうど腹第三のいずれかの端に1つにすることによってこれを行います。離れて卵黄granulから皿のきれいな部分に各解剖神経管/筋節を移動ESおよび他の残骸（ 図4B）。背腹軸、および神経管と筋節の位置は図4に示されている。 この溶液中の約15分後（CMF）の解剖組織および廃棄の自由色素沈着した皮膚を持ち上げるためにピンセットを使用しています。彼らは互いに（ 図4C）から解離になるその他の30〜60分後、細胞は"砂杭"を形成することになる。 3。神経筋共培養の準備培地を10 mlチューブを解凍し、無菌的にITSの70μlを添加し、35 ng / mlのBDNF（シグマB3795）。 ラベルおよび滅菌35mm培養皿（FD35-100世界の精密機器）のほぼ中間のL-15培地（溶液（e））は、解剖し、各胚のための1とを埋める。 炎の上にテーパ部を保持している間にガラスパスツールピペットの両端をつかんでメッキピペットを作製します。約1に端を引き離す次いで、0センチメートルと約0.2mmの先端を得るためにエンドを断つ。 描かれた溶液の量を最小限に抑える1つの胚から "砂杭"を吸い上げるメッキピペットを使用しています。培養皿の底に細胞を追い出す。いくつかの行に分割プレートの細胞を。メッキされた未分化細胞（ 図5Aおよび5B）に従ってください。 細胞は時間が皿にアタッチできるように、少なくとも15分間静置播種した細胞の料理にしておきます。 4。パッチクランプ神経筋シナプス筋細胞は紡錘形となり、脊髄神経細胞は長い突起（ 図6）を拡張：培養液中で12から24時間後、播種した細胞は、異なる形態的特徴にかかる。神経突起varicositiesと筋細胞間の機能的なシナプスの接触が同時対に電気生理学的記録で確認することができます。 "M"、 "S"と "V"は神経、筋細胞にそれぞれ参照してください。ソーマとシナプス前静脈瘤。 シナプス前静脈瘤のためのものと筋細胞のための1：録音のための2つのパッチ電極を準備します。 シナプス前の電極については、次のようにアムホテリシン含有溶液を調製：5 mgのアムホテリシンB（シグマA4888）を含む1.5 mlマイクロチューブに100μlのDMSOを追加します。 10秒間ボルテックスこのソリューション。次に、アムホテリシンB（溶液（H））のために625μlのK +内部 ​​溶液を含む第二のマイクロ遠心チューブにこの溶液10μlを添加する。上記のように渦。 ステップ4.3で調製したアンホテリシン含有のK +内部 ​​溶液とK +内部 ​​液（溶液（グラム））とシナプス電極を使ったプレシナプス電極を埋める。 NFRと培養皿の中でメディアを交換して、位相差光学系を搭載倒立顕微鏡に変える。 ただ、それぞれの対象の上に両方の電極を配置します。細胞全体の協力を得る静脈瘤電極を備えた穿孔パッチ設定の前筋細胞電極とnfiguration。 シナプスの機能を確認するには、ソフトウェア制御の下で（ 例えば Axopatch 200B、Molecular Devices）をパッチクランプアンプで静脈瘤を脱分極（pCLAMP 9、Molecular Devices社など ）と同時シナプス前とシナプス後電流を観察します。 図7を見電流を示し+40 mVへ-30 mVから10 mV刻みでシナプス前静脈瘤に与えられる電圧のステップを脱分極への返信です。シナプス前細胞に見られる内向き電流は、Na ​​+とCa 2 +とK +による外向き電流によって運ばれる。シナプス後細胞に記録電流が静脈瘤から放出された神経伝達物質への応答であるとニコチン性アセチルコリン受容体チャネルを介したNa +が主に行われている。