في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من<em> القيطم</em> العصبي العضلي المشارك الثقافات
Summary
هذا الفيديو يوضح الإجراءات التي تستخدم لزراعة الثقافات الرئيسي لالجنينية<em> القيطم</em> العصبية والخلايا العضلية وفائدة هذا المستحضر في وقت واحد لصنع المشبك التصحيح قبل وبعد المشبكي-التسجيلات.
Abstract
لقد تم الحصول على الكثير من المعلومات حول توصيل التيارات الأيونية قبل المشبكي مع الافراج عن ناقل عصبي من الاستعدادات اللافقارية، وأبرزها الحبار العملاق المشبك 1. ومع ذلك، ما عدا لإعداد وصفها هنا، الاستعدادات الفقاريات القليلة التي توجد في أنه من الممكن أن إجراء قياسات في وقت واحد من الافراج عن ناقل عصبي والتيارات الأيونية قبل المشبكي. يمكن زراعتها الجنينية العصبونات الحركية القيطم وخلايا العضلات معا في ثقافة المتوسط بسيطة في درجة حرارة الغرفة، وسوف تشكل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية ضمن 12-24 ساعة، ويمكن استخدامها لدراسة الأعصاب والعضلات وتطور الخلايا التفاعلات متشابك لعدة أيام (حتى فرط يحدث). بعض مزايا هذه الثقافات المشتركة على مدى الاستعدادات الفقاريات الأخرى تشمل إعداد بساطة، والقدرة على الحفاظ على الثقافات والعمل في درجة حرارة الغرفة، وإمكانية الوصول من نقاط الاشتباك العصبي استعداد المشكلة 2-4. وقد استخدم على نطاق واسع لإعداد دراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية من القنوات الأيونية قبل المشبكي وتنظيم إصدار الارسال 5-8. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت المستحضر ذاته إلى استخدامات أخرى بما في ذلك دراسة ثمرة محوار وsynaptogenesis 9-12، الآليات الجزيئية لإطلاق ناقل عصبي 13-15، دور الرسل في تعديل العمليات العصبية إنتشاري 16،17، واللدونة متشابك في المختبر 18 – 19.
Protocol
1. قبل إعداد التجريبية إعداد الحلول التالية (انظر الجدول 1 للتركيبات): (أ) 1 لتر NFR (عادي قارع الأجراس الضفدع)، (ب) 100 مل المالحة 10٪، (ج) 100 مل CMF (كا 2 + / 2 ملغ + خالية من الحل (و) د) 1 مل ITS (الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم، سيغما I1884) و (ه) 100 مل المتوسطة L-15 والثقافة، (و) 10 مل HCG (الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية سيغما CG-10)، (ز) 100 مل K +-الداخلية حل، (ح) 100 مل +-K الداخلية حل لB. الامفوتريسين يجب أن يتم التحقق من قوة التناضحي الحل 1 إلى ضمان أن تكون يقرب من 260 الميلي أسمول باستخدام مقياس التناضح ضغط البخار (مثل نموذج Wescor # 5100C) . تصفية تعقيم حلول (ب) و (ج) حلول (أ) (ب) و (ج) ويمكن تخزين ما يصل إلى ثلاثة أشهر في C. ° 4 إعداد الحل (د) عن طريق إضافة 1 مل منزوع الأيونات H 2 O إلى قارورة تحتوي على مسحوق مجفف بالتجميد عن طريق حقنة إبرة قياس 25 و تصفية حقنة. هذا الحل النهائي جويتم تخزين في C ° 4 لمدة 30 يوما. إعداد الحل (ه) في الصفحي هود تدفق من خلال الجمع بين جميع المكونات في دورق أو قارورة. تصفية تعقيم الحل النهائي وتحويل 10 مليلتر مأخوذة في أنابيب الطرد المركزي العقيمة. مخزن في -20 ° C. إعداد HCG (حل (و)) وذلك بإضافة 10 مل منزوع الأيونات H 2 0 إلى قارورة تحتوي على مسحوق مجفف بالتجميد عن طريق حقنة إبرة قياس 25 و تصفية حقنة. يمكن تخزين هذا الحل النهائي في C ° 4 لمدة 30 يوما. تسليخ مجهري افتعال أدوات اثنين على الأقل من لصق دبوس Minutien (26002-10 أدوات العلوم الجميلة) إلى نهاية ماصة باستور الزجاج مع الغراء CYANOACRYLATE. السماح للنهاية حادة من دبوس تمديد بعد نهاية ماصة ما يقرب من 0.5 سم. قبل يومين من إعداد الثقافات، حمل تربية للإجراء التالي. تحديد الزوج تربية جاهزة من خلال مراقبة القيطم بارز، مجرور المحمر على الإناث وتصبغ الظلام على مستو سوrface من الكفوف أمام الرجال. في وقت واحد، كل صافي الضفدع والاحتفاظ بها الجانب البطني أسفل على بالوعة مع صافي بحيث لا يمكن الفرار. حقن 1 مل من محلول (و) من خلال واحد وصافي في تحت الجلد من الحويصلات الليمفاوية الظهرية. وضع الزوج تربية معا في خزان جالون غطت عشرة من المياه. للتأكد من أن الحيوانات لن تدوس على البيضات والمخصبة، تثبيت أرضية فرزهم مع حجم فتحات الشباك من حوالي ½ "مزودة حوالي 1-2 بوصة فوق قاع الخزان (الشكل 1A). ترك الضفادع دون عائق ل12-48 ساعة حتى الحيوانات في تعناق ويلاحظ البويضات المخصبة في الطابق تحت الشاشة (1B الشكل). إزالة الحيوانات من الخزان، ولكن ترك البيض دون عائق للا يقل عن 24 ساعة لفترة أطول. ويمكن هذا الزوج من الضفادع إعادة لدت بعد ستة أسابيع. تخفيف الأجنة من قاع الخزان ونقلها إلى أربعة أو خمسة عبادة مم 60×15الأطباق المالحة التي تحتوي على لدى عودتهم 10٪ (حل ب). فرز الأجنة حسب المرحلة وفقا للمخطط Niewkoop وفابر (المرجع 20). وسوف تكون تلك الأجنة مفيدة في مرحلة 22-24. 2A الشكل يظهر الجنين في مرحلة ما يقرب من 22 في حين الشكل 2B يظهر الجنين الذي هو بعيد جدا في التنمية جنبا إلى جنب لتكون مفيدة (المرحلة حوالي 28). من المهم اختيار الأجنة التي يتمتعون بصحة جيدة: تلك التي هي على نحو سلس في المظهر مع البني الفاتح والأبيض التبقيع مثالية. الأجنة التي لديها بقع كبيرة سوداء أو بيضاء عادة ما تكون غير صحية وغير صالحة للاستعمال. 2. تسليخ مجهري من الأجنة القيطم داخل تسمية تدفق الصفحي، وملء غطاء محرك السيارة في منتصف الطريق تقريبا 3 مم 60×15 الأطباق المالحة الثقافة العقيمة مع 10٪، واحد مع CMF. باستخدام العقيمة، والزجاج ماصة باستور نقل 5-10 22-24 مرحلة الأجنة إلى واحدة من أطباق تحتوي على محلول ملحي 10٪. مع المعونة من التكبير ستيريو تشريحجي المجهر داخل غطاء محرك السيارة (0.6-5X مع العدسات × 10)، وإزالة طبقة الغشاء المحي معقود الفواكه والجنين من كل اثنين من أزواج من استخدام ملقط معقم رقم 5 (11251-30 أدوات العلوم الجميلة). (انظر الشكلين 3A 3B و.) غسل الأجنة العارية عن طريق تمرير لها، في وقت واحد، من خلال الأطباق المالحة المتبقيين من 10٪، وأخيرا في صحن يحتوي على CMF. استخدام جديد، ماصة معقمة في كل نقل والتقليل من حجم الطبق من حل نقل إلى طبق. بدوره، عقد كل الجنين بلطف ولكن بحزم مع زوج من ملقط و، وذلك باستخدام أداة تسليخ مجهري الطراز في الخطوة 1.5، إزالة الأنبوب العصبي وmyotomes المرتبطة والتي تقع في الجانب الأكثر الظهرية للحيوان. القيام بذلك عن طريق ثلاث شرائح، واحدة على طرفي مكان الأنبوب العصبي وثلث بطني فقط لأنه (الشكل 4A). نقل كل أنبوب تشريح العصبية / بضعة عضلية على جزء نظيف من الطبق بعيدا عن صفار granulوفاق وغيرها من الحطام (الشكل 4B). يشار إلى محور ظهري بطني، ومواقع الأنبوب العصبي وmyotomes في الشكل 4. بعد حوالي خمس عشرة دقيقة في هذا الحل ملقط استخدام (CMF) لرفع الجلد المصطبغة خالية من الأنسجة تشريح والتخلص منها. بعد دقيقة إضافية 30-60، وخلايا تشكيل "كومة الرمل" عندما تصبح فصلها عن بعضها البعض (الشكل 4C). 3. إعداد العصبي العضلي الثقافات المشارك ذوبان الجليد أنبوب 10 مل من مستنبت وإضافة جو معقم و مطهر 70 ميكرولتر ITS و 35. نانوغرام / مل BDNF (سيغما B3795) التسمية وملء العقيمة 35 ملم الأطباق ثقافة (FD35-100 أدوات دقيقة العالمي) في منتصف الطريق تقريبا مع متوسط L-15 الثقافة (حل (ه))، واحد لكل الجنين تشريح. افتعال ماصة الطلاء من استيعاب كل نهاية ماصة باستور الزجاج حين عقد الجزء مدبب أكثر من اللهب. سحب نهايات على حدة لحوالي 10 سم وكسر ثم قبالة نهاية لتسفر عن غيض من حوالي 0.2 ملم. استخدام ماصة لتمتص الطلاء على "كومة الرمل" من جنين واحد التقليل من كمية حل مرسومة. طرد الخلايا على الجزء السفلي من طبق الثقافة. لوحة الخلايا في عدة أسطر. مراقبة خلايا غير متمايزة مطلي (الشكل 5A و 5B). ترك الأطباق من الخلايا مطلي دون عائق لمدة لا تقل خمس عشرة دقيقة للسماح للخلايا الوقت لنعلق على الطبق. 4. التصحيح المشبك العصبي العضلي الوصلات العصبية بعد 12-24 ساعة في الثقافة، والخلايا مطلي تأخذ على الصفات المورفولوجية متميزة: خلايا العضلات تصبح المغزل على شكل الخلايا العصبية في العمود الفقري وتوسيع نطاق العمليات الطويلة (الشكل 6). ويمكن التأكد من اتصال متشابك وظيفية بين دوالي محوار وخلايا العضلات في وقت واحد مع التسجيلات الكهربية المقترنة. "M"، "S" و "V" تشير على التوالي إلى الخلايا العضلية، العصبيةسوما ودوالي قبل المشبكي. إعداد أقطاب التصحيح اثنين للتسجيل: واحد للدوالي قبل المشبكي واحد للخلية العضلية. لقطب قبل المشبكي، يعد الحل الأمفوتريسين المحتوية على النحو التالي: أضف 100 ميكرولتر DMSO إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 5 ملغ الأمفوتريسين B (سيغما A4888). دوامة هذا الحل لمدة 10 ثانية. المقبل، إضافة 10 ميكرولتر من حل لهذه أنبوب microcentrifuge الثاني الذي يحتوي على 625 ميكرولتر K +-B الداخلية حل لالامفوتريسين (الحل (ح)). دوامة على النحو الوارد أعلاه. ملء القطب قبل متشابك مع الأمفوتريسين K +-المحتوية على استعداد الداخلية حل في الخطوة 4.3 و القطب بعد متشابك مع الحل +-K الداخلية (الحل (ز)). استبدال وسائل الإعلام في الطبق الثقافة مع NFR والانتقال إلى مجهر مقلوب مزودة البصريات النقيض المرحلة. وضع أقطاب كهربائية على حد سواء فوق أهداف كل منها. الحصول على تعاون كامل الخليةnfiguration مع العضلات الكهربائي الخلية قبل تكوين التصحيح مثقبة مع القطب دوالي. لتأكيد وظيفة من المشبك، يزيل الاستقطاب في دوالي مع مكبر للصوت المشبك التصحيح (على سبيل المثال Axopatch 200B، الأجهزة الجزيئية) تحت السيطرة البرمجيات (مثلا عن طريق pCLAMP 9، الأجهزة الجزيئية) ومراقبة التيارات في وقت واحد قبل المشبكي وبعد المشبكي. الشكل 7 يبين التيارات ينظر ردا على إزالة إستقطاب الخطوات من الجهد نظرا لدوالي قبل المشبكي في 10 زيادات بالسيارات من -30 إلى +40 بالسيارات بالسيارات. وتنفذ التيارات الداخل ينظر في الخلية قبل المشبكي بواسطة + الصوديوم والكالسيوم 2 + والتيارات الصادرة موزعة حسب K +. التيارات سجلت في الخلية بعد المشبكي هي الردود على ناقل عصبي التي صدرت من دوالي وتتم في الغالب من قبل + نا من خلال قنوات النيكوتينيك مستقبلات أستيل.
Representative Results
الرقم 4B يظهر عرض الظهرية من العمود الفقري الحبل معزولة / مباشرة بعد بضعة عضلية زواله من مرحلة الجنين 22 القيطم. الشكل 4C يبين أنه بعد إزالة الجلد والحضانة في كاليفورنيا 2 + 2 + المغنيسيوم، خالية من الحل (CMF، الحل ( ج))، والخلايا في فصل "كومة الرمل" ونحن على استعداد لطلاء. مباشرة بعد الطلاء إلى خلايا متوسطة الثقافة يحمل تقلب قليلا المورفولوجية (الشكل 5B) ولكن تأخذ على اشكال مختلفة بعد أربع وعشرين ساعة في الثقافة. خلايا العضلات تصبح المغزل على شكل الخلايا العصبية في حين تبقى كروية في حين أن تمتد neurites التي varicosites وضع نقاط الاشتباك العصبي في خلايا العضلات مع (الشكل 6). في وقت واحد تسجيل التصحيح المقترنة من دوالي قبل المشبكي وبعد المشبكي الخلايا العضلية (الشكل 7) يكشف عن التيارات قبل المشبكي الداخل والخارج المرتبطة الافراج عن ناقل عصبي وresulta للإثاري NT التيارات بعد المشبكي. الشكل 1 A:. الزوج تربية الضفادع في دلو التزاوج فوق الشاشة B: الضفادع في تعناق مع البيض المخصب. الشكل 2 A:. B "مناسبة" مرحلة الجنين 22: "غير مناسبة" مرحلة الجنين 28. شريط النطاق يمثل 1 ملم. الشكل 3 A:. المرحلة 22 الجنين قبل إزالة الغشاء المحي ومعطف هلام. السهم يشير إلى الحافة الخارجية للمعطف هلام. الغشاء المحي تتمسك بشكل وثيق embrيو وغير مرئي تقريبا B: باري الجنين. شريط النطاق يمثل 1 ملم. الشكل 4 A: المرحلة 22 الجنين مع خط متقطع يدل إلى أن تشريح جزء B:. جزء الظهرية معزولة تماما للجنين؛ "د" و "V" تشير إلى جوانب ظهري وبطني من الأجنة، في حين أن "م" و "N" تشير إلى مواقع التقريبي للmytomes والأنبوب العصبي C: ". كومة رمل" من الخلايا بعد 60 دقيقة في CMF. شريط النطاق يمثل 1 ملم لA، و 0.5 مم للB و C. الرقم 5 A: 5X عرض الطاقة من الخلايا في الثقافة مباشرة بعد الطلاء. B: نفس الثقافة في 40X. جدولشريط تمثل 40 ميكرومتر لA، و 5 ميكرومتر لB. الشكل 6. الموصل العصبي العضلي في الثقافة مع تحديد الخلايا العصبية سوما (S)، دوالي قبل المشبكي (V)، وبعد المشبكي الخلايا العضلية (M). مقياس بار: 5 ميكرون. الخطوات قدم الشكل 7. قبل المشبكي (أعلى) وبعد المشبكي (القاع) ينظر التيارات استجابة لطلب من الجهد بالسيارات الإضافية 10 إلى دوالي قبل المشبكي من -30 إلى +40 بالسيارات بالسيارات. يشار إلى الخطوات التالية لبعض الجهد من آثار قبل المشبكي. وكان احتمال عقد لكلا الخلايا -70 بالسيارات.
Discussion
الخطوات الرئيسية في زراعة المشترك الناجح لالعصبونات الحركية والخلايا العضلية هي استخدام نظم مناسب الأجنة الناتجة عن التفريخ الصناعي من الضفادع القيطم، وتشريح دقيق العقيم من الخلايا العصبية في العمود الفقري وغير متمايزة myoblasts. ينبغي أن يترك البيض المخصب دون عائق حتى تصل مرحلة ما يقرب من 10 أو حتى نقلها عاجلا في كثير من الأحيان توقف نموهم. يتم تحديد الأجنة صحية من خلال مظهر ناعم والأبيض والبني مرقش التلوين. المرحلة 22-24 الأجنة هي أكثر فائدة لأن هذا هو نقطة خلال التنمية مباشرة بعد إغلاق الأنبوب العصبي وقبل myocytes ومتباينة بشكل كبير. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا الأجنة من كبار السن لا فصل بشكل جيد في CMF. وينبغي توخي الحذر عند إزالة الغشاء المحي كما تتمسك بشدة على الجنين. وينبغي أن تمزق الغشاء عدا باستخدام ملقط حاد بحيث يخرج الجنين سليما. آخر precautio هامةن هو بعناية وضع الخلايا على الجزء السفلي من طبق الثقافة (بدلا من السماح لهم بتسوية هناك). ويفضل هذه الطريقة لأن هذا يزيد من احتمال أن الخلايا ستلتزم الطبق الثقافة.
يمكن تحديد العصبي الوظيفي بين الأعصاب والعضلات مع تسجيل بعد المشبكي فقط، وغالبا ما يمكن التأكد من رصد تقلص العضلات بعد تعصيب عفوية. خلايا العضلات من الامم المتحدة ومعصب لا نشل في الثقافة. تسجيل بعد المشبكي وحده مفيدا لتسجيل التيارات endplate مصغرة أو إمكانات ولكن قياسات الإفراج أثار يتطلب التحفيز قبل المشبكي، وعلاقة التيارات قبل وبعد المشبكي يتطلب التصحيح، المشبك المزدوج.
وإلى جانب طريقة التسجيل تقرن التصحيح الموصوفة هنا، هذا المستحضر يتيح الفرصة لإدخال ماصة الثالث في الخلايا العصبية سوما 5 هذا يسمح للجيل إجراء ثا المحتملةيمكن ر نشر إلى دوالي قبل المشبكي وتؤدي إلى الإفراج عن الناقلات العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض وكلاء المفترضة التي يعتقد للتوسط أو تعدل انتقال متشابك على جانبي المشبك: عن طريق العضلات أو عن طريق ماصة خلية من نشر ماصة صاحب المركز الثالث في سوما.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتمويل من NSF (0854551).
Materials
| Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.
References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -. M., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
Cite This Article
Yazejian, B., Yazejian, R. M., Einarsson, R., Grinnell, A. D. Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures. J. Vis. Exp. (73), e50253, doi:10.3791/50253 (2013).