Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-инфицированных мышей
Summary
Метод выделения приверженцем воспалительных лейкоцитов из мозга кровеносных сосудов<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-инфицированных мышей описано. Метод позволяет количественное, а также фенотипической характеристике изолированного лейкоцитов после окрашивания флуоресцирующих антител и последующий анализ с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Мы описываем метод выделения и характеристика приверженцем воспалительных клеток из мозга кровеносных сосудов P. berghei ANKA-инфицированных мышей. Заражение восприимчивых мыши штаммов с этим паразитом результаты напряжение в индукционной экспериментальной церебральной малярии, неврологического синдрома, который повторяет некоторые важные аспекты Plasmodium тропической опосредованной тяжелой малярии в 1,2 человека. Зрелые формы крови стадии малярии выразить паразитарных белков на поверхности зараженных эритроцитов, что позволяет им связываться с сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс вызывает препятствия в кровоток, что приводит к гипоксии и кровоизлияния 3, а также стимулирует набора воспалительных лейкоцитов к месту паразита углерода.
В отличие от других инфекций, т.е. neutrotopic вирусы 4-6, как малярия зараженных эритроцитов (PRBC), а также связанные InflammAtory лейкоцитов оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают в паренхиму мозга. Таким образом, чтобы избежать загрязнения поглощенных лейкоцитами с невоспалительные циркулирующих клеток, обширная внутрисердечной перфузии зараженных мышей до извлечения органов и тканей, обработка требуется в этой процедуре, чтобы удалить кровь отсека. После перфузии мозга собирают и расчлененные на мелкие кусочки. Структуры тканей в дальнейшем нарушается ферментативной обработки с коллагеназы D и ДНКазы I. В результате мозг гомогенат центрифугировали в градиенте Percoll, который позволяет разделение мозга секвестрированных лейкоцитов (BSL) из миелина и другим мусором ткани. Изолированные клетки затем промывают, рассчитывали с использованием гемоцитометр и окрашенных флуоресцирующих антител для последующего анализа методом проточной цитометрии.
Эта процедура позволяет комплексно фенотипическая характеристика воспалительных лейкоцитов мигрируют в мозг, в реответа на различные раздражители, в том числе инсульта, а также вирусных и паразитарных инфекций. Этот метод также является полезным инструментом для оценки романа противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделения и анализа BSL это метод, который позволяет характеристика и количественная воспалительных клеток мигрируют в мозг в ответ на повреждение ткани или инфекции в экспериментальной модели мышей. Введение внутрисердечной шаг перфузии для удаления крови отсека до извлечения орган?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить мисс Лиана Мацкевич технической помощи. Эта работа стала возможной благодаря викторианской государственного управления оперативной поддержки инфраструктуры и австралийское правительство национального здравоохранения и медицинских исследований Совета IRIISS и гранта 1031212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
