العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em> المتصورة berghei</em> ANKA الفئران المصابة
Summary
وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ من<em> المتصورة berghei</emيوصف> ANKA الفئران المصابة. الأسلوب الكمي يسمح كذلك توصيف المظهري من الكريات البيض المعزولة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة وتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.
Abstract
وصفنا طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الالتهابية تمسكا من الأوعية الدموية في الدماغ من P. berghei ANKA المصابين الفئران. إصابة السلالات الحساسة الفأر مع هذه النتائج سلالة الطفيلي في استحثاث الملاريا الدماغية التجريبية، وهي متلازمة عصبية أن يجمل جوانب هامة معينة من الملاريا المنجلية المتصورة بوساطة شديد في 1،2 البشر. أشكال ناضجة من الدم في مرحلة التعبير عن الملاريا الطفيلية البروتينات على سطح كرات الدم الحمراء للمصاب، مما يسمح لهم لربط الخلايا البطانية في الأوعية الدموية. هذه العملية يدفع عوائق في تدفق الدم، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة والنزيف 3 و يحفز أيضا تجنيد الكريات البيض الالتهابية إلى موقع تنحية الطفيليات.
على عكس غيره من الأمراض والفيروسات neutrotopic أي 4-6، على حد سواء الملاريا الطفيلي خلايا الدم الحمراء (pRBC) وكذلك يرتبط بها من inflammالكريات البيض atory تبقى المحتبسة داخل الأوعية الدموية بدلا من التسلل لحمة الدماغ. وبالتالي لتجنب التلوث من الكريات البيض مع المنظمات غير المعزول للالتهابات الخلايا المنتشرة، نضح intracardial واسعة من الفئران المصابة قبل استخراج الجهاز ومعالجة الأنسجة هو مطلوب في هذا الإجراء لإزالة الدم المقصورة. بعد نضح، ويتم حصاد العقول وتشريح في قطع صغيرة. وتعطلت كذلك بناء الأنسجة عن طريق العلاج الأنزيمية مع collagenase وI. D الدناز يتم طرد جناسة الدماغ ثم الناتجة عن الانحدار الذي يسمح Percoll الفصل بين الدماغ المعزول الكريات البيض (BSL) من المايلين وغيرها من الحطام الأنسجة. عد الخلايا ثم تغسل المعزولة، وذلك باستخدام عدادة الكريات والملون مع الأجسام المضادة للتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.
هذا الإجراء يسمح توصيف المظهري شاملة من الكريات البيض الالتهابية الهجرة إلى الدماغ في إعادةاالستجابة للمؤثرات المختلفة، بما في ذلك السكتة الدماغية وكذلك العدوى الفيروسية أو الطفيلية. الأسلوب يوفر أيضا أداة مفيدة لتقييم العلاجات المضادة للالتهابات رواية في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل وتحليل BSL هو وسيلة تسمح توصيف وتقدير من الخلايا الالتهابية الهجرة إلى الدماغ استجابة لإصابة الأنسجة أو العدوى في نماذج الماوس التجريبية. إدخال خطوة نضح intracardial لإزالة المقصورة الدم قبل استخراج الجهاز والعزلة اللاحقة خلية مفيد لمنع التلوث من الخلايا الالتهابية م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الآنسة ليانا Mackiewicz للمساعدة التقنية. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال دعم حكومة الولاية الفيكتوري البنية التحتية التشغيلية والحكومة الأسترالية الوطنية للصحة والبحوث الطبية IRIISS المجلس ومشروع منح 1031212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
