Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em> Plasmodium berghei</em> ANKA topi infettati
Summary
Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei<em> Plasmodium berghei</em> ANKA topi infettati è descritto. Il metodo consente la quantificazione e caratterizzazione fenotipica di leucociti isolati dopo colorazione con anticorpi fluorescenti e successiva analisi mediante citometria a flusso.
Abstract
Si descrive un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L'infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in 1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e 3 emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita.
A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic 4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all'interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell'estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L'omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso.
Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolamento e l'analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L'introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell'estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la signorina Liana Mackiewicz per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato reso possibile grazie vittoriana sostegno governativo Infrastrutture Stato operativo e del governo australiano National Health and Medical Research Council IRIISS e Progetto di sovvenzione 1.031.212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
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