בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em> Plasmodium berghei</em> עכברי אנקה נגוע
Summary
שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח<em> Plasmodium berghei</em> עכברי אנקה נגוע מתוארים. השיטה מאפשרת כימות, כמו גם אפיון הפנוטיפי של לויקוציטים הבודד לאחר ההכתמה עם נוגדני ניאון וניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.
Abstract
אנו מתארים שיטה לבידוד ואפיון של תאי דלקת חסיד מכלי דם במוח של פ עכברי berghei אנקה נגוע. זיהום של-זני עכברים רגישים עם תוצאות מתח טפיל זה באינדוקציה של קדחת מוח ניסיונית, תסמונת נוירולוגית שחוזר על היבטים חשובים מסוימים של מלריה חמורה Plasmodium falciparum בתיווך ב1,2 בני האדם. צורות בוגרות של מלריה בדם שלב לבטא חלבונים טפילים על פני השטח של כדורי האדום הנגוע, המאפשר להם להיקשר לתאי האנדותל של כלי דם. תהליך זה גורם לחסימות בזרימת דם, וכתוצאה מהיפוקסיה ושטפי דם 3 וגם ממגר את הגיוס של לויקוציטים הדלקתי לאתר של קיבוע טפיל.
בניגוד לזיהומים אחרים, וירוסים כלומר neutrotopic 4-6, שני תאי המלריה parasitized דם האדומים (pRBC), כמו גם הקשור inflammleukocytes atory יישאר מוחרם בתוך כלי דם ולא מסתנן parenchyma המוח. לפיכך, כדי למנוע זיהום של לויקוציטים המוחרם עם תאים שאינם דלקתיים במחזור, זלוף intracardial הנרחב של עכברים נגועים לפני חילוץ איברים ועיבוד רקמות נדרש בהליך זה כדי להסיר את תא הדם. לאחר זלוף, המוח נקצר ומבותר לחתיכות קטנות. מבנה הרקמה שבש עוד יותר על ידי טיפול האנזימטית עם collagenase D וDNAse I. אז homogenate המוח וכתוצאה הוא centrifuged בשיפוע Percoll המאפשר פרדה של לויקוציטים מוח המוחרם (מנהלת ליגה) מהמיאלין ופסולת רקמות אחרות. תאים מבודדים אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer ומוכתם עם נוגדני ניאון לניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.
הליך זה מאפשר אפיון הפנוטיפי מקיף של לויקוציטים הדלקתי נודד למוח מחדשsponse לגירויים שונים, כולל שבץ, כמו גם זיהומים נגיפיים או טפילים. השיטה מספקת גם כלי שימושי להערכת טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבידוד והאנליזה של מנהלת הליגה הוא שיטה המאפשרת אפיון וכימות של תאים דלקתיים הנודדים למוח בתגובה לפגיעה ברקמות או זיהום במודלים של עכברי ניסוי. ההקדמה של צעד זלוף intracardial להסרת תא הדם לפני חילוץ איברים ובידוד התא הבא היא שימושית כדי למנוע זיהום של תאים דלקתיים עם לוי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למיס ליאנה מצקייביץ' לסיוע טכני. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני מדינת ממשלה התפעולית תשתיות וממשלה האוסטרלית הלאומיים בריאות והמועצה למחקר הרפואי IRIISS והפרויקט גרנט 1031212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
