Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen
Summary
Wir beschreiben einen qualitativen Test auf bakterielle Wettbewerb durch die vermittelten überwachen<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Type VI Sekretionssystem (T6SS). Der Assay beruht auf der Überlebensrate / Abtötung von Escherichia coli eine tragende Zielzellen<em> LacZ</em>-Reporter. Diese Technik ist einstellbar, um die bakteriziden / Bakteriostase Aktivität T6SS-kompetente Mikroorganismen einzuschätzen.
Abstract
Typ VI Sekretionssysteme (T6SSs) sind molekulare Nanomaschinen ermöglichen Gram-negativen Bakterien zu transportieren und zu injizieren Proteine in einer Vielzahl von Zielzellen 1,2. Die T6SS besteht aus 13 Kern-Komponenten und zeigt strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Schwanz-Rohr von Bakteriophagen 3. Der Phage verwendet ein Rohr und ein Stechgerät die Zellhülle von Ziel-Bakterien eindringen und injizieren DNA. Es wird vorgeschlagen, dass die T6SS ein invertiertes Bakteriophagen Vorrichtung Schaffung eines spezifischen Pfades in der bakteriellen Zellwand und Toxine Effektoren an die Oberfläche zu treiben. Das Verfahren könnte weiterhin entnommen werden, und die Vorrichtung könnte T6SS anderen Zellen, mit denen das Bakterium in Kontakt zu perforieren, wodurch die Injektion der Effektoren in diesen Zielen. Der Schwanz Rohr und Stechgerät Teile der T6SS mit Hcp und VgrG Proteinen bzw. 4,5.
Die Vielseitigkeit des T6SS wurde durch s nachgewiesenTUDIEN mit verschiedenen bakteriellen Erregern. Die Vibrio cholerae T6SS enthaltene Zytoskelett eukaryontischer Wirtszellen durch Einspritzen eines "entwickelt" VgrG Tragen eines C-terminalen Aktin Vernetzen Domäne 6,7 umzugestalten. Ein weiteres eindrucksvolles Beispiel wurde kürzlich dokumentiert mit Pseudomonas aeruginosa in der Lage, anzugreifen und zu töten Bakterien in einem T6SS-abhängigen Weise, also die Förderung der Errichtung von Bakterien in spezifischen mikrobiellen Nischen und Wettbewerbsumfeld 8,9,10 ist.
Im letzteren Fall sind drei T6SS-sekretierte Proteine, nämlich Tse1, Tse2 und TSE3 wie die Toxine in den Zielbakterien (Abbildung 1) injiziert identifiziert. Donorzelle ist aus der schädlichen Wirkung dieser Effektoren über einen Anti-Toxin-Mechanismus, durch den TSI1, TSI2 und Tsi3 Immunität Proteine vermittelt 8,9,10 geschützt. Dieses antimikrobielle Aktivität kann überwacht werden, wenn T6SS-kompetenten Bakterien zu n cokultiviert werdenolid Oberflächen im Wettbewerb mit anderen Bakterienarten oder mit T6SS-inactive Bakterien der gleichen Art 8,11,12,13.
Die verfügbaren Daten betonte eine numerische Annäherung an die bakterielle Kompetitionsassay, einschließlich zeitaufwändig CFU Zählen, das hängt stark von Antibiotika Entscheidungsträger. Im Fall von antibiotikaresistenten Stämmen wie P. aeruginosa, können diese Methoden ungeeignet sein. Ferner mit der Identifizierung von etwa 200 verschiedenen T6SS Loci in mehr als 100 Bakteriengenome 14, ist eine bequeme Screening-Werkzeug sehr wünschenswert. Wir entwickelten einen Test, der einfach zu bedienen ist und erfordert Standard-Labor-Material und Reagenzien. Das Verfahren bietet eine schnelle und qualitative Technik, um die T6SS-abhängige bakterizide / Bakteriostase-Aktivität durch Verwendung eines Reporter-Stamm als Beute (in diesem Fall Escherichia coli DH5a) Zulassen einer-Komplementation des lacZ-Gens zu überwachen. Insgesamt ist dieses Verfahren graphic und ermöglicht eine schnelle Identifizierung von T6SS-bezogene Phänotypen auf Agarplatten. Dieses experimentelle Protokoll kann auf andere Stämme oder Bakterienspezies unter Berücksichtigung der besonderen Bedingungen wie Wachstumsmedium, Temperatur oder Zeit des Kontaktes angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode in diesem Artikel vorgestellt ermöglicht eine visuelle Beobachtung der T6SS-vermittelte bakterizide / Bakteriostase Aktivität. Der Assay basiert auf der Oberfläche einer Agarplatte durchgeführt. Es wurde zuvor gezeigt, dass T6SS-abhängigen Abtötungsassay mit gemischten bakteriellen flüssigen Kultur durchgeführt nicht effizient ist, wahrscheinlich wegen der fehlenden stationären Kontakt zwischen den beiden Bakterien 8. Die T6SS wird angenommen, dass mit einem Mechanismus ähnlich dem von Bakteriophagen verwendet, um DNA in Zielzellen 17 einzuspritzen betreiben. In flüssiger Kultur, die röhrenförmige Struktur des T6SS kann leichter brechen können inter-bakterielle Kontakt verloren, und die Giftstoffe nicht effizient bereitgestellt.
In Bezug auf die Inkubationszeiten, sind die 5 ersten Stunden der Kontakt, den wir beschreiben, zwischen dem Donorstamm und die Beute aus, um bakterielle Tötung zwischen P. beobachten aeruginosa und E. coli, wie in Abbildung 3 dargestellt </strong>. Trotzdem ist es empfehlenswert, die Inkubationszeit durch Durchführung einer kinetischen um die Versuchsbedingungen zu optimieren einzustellen.
Da dieses Verfahren eine Farbe basierten Technik können die Ausgabeergebnisse vom Pigmentierung der Donorstamm beeinträchtigt werden. Zum Beispiel werden im Fall von S. aeruginosa, produzieren einige Stämme hohe Buntpigmente wie Pyocyanin und Pyoverdin, das mit dem Assay Auslesen stören können, wodurch der Unterschied zu der Beute relativ schwierig. Andere chromogene β-Galactosidase-Substrate, wie der Magenta-gal oder die rot-gal, kann anstelle des X-gal (Tabelle 1) verwendet werden.
Der Wettbewerb Assay kann Verwendung anderer Reportergene für das Auslesen machen. So hat ähnlichen Assay auch durch Verwendung grün fluoreszierendes Protein-markierten preys 12 durchgeführt.
Unser Test zwar nicht quantitativ, gibt einen guten Hinweisder T6SS Aktivität, da sie auf das Überleben oder die Tötung eines Reporters Beute basiert. Diese Technik bietet den Vorteil, dass sie einfach und bequem, die bakterizides / Bakteriostase Aktivität T6SSs aus beliebigen Bakterien-Spezies zu evaluieren. Bisher war die Aktivität des T6SS hat gegen Gram-negative Bakterien und keine klare Beispiels T6SS-sensitive gram-positive Bakterien gezeigt wurde berichtet noch 12. Es ist auch offensichtlich, dass in der Kultur Inkompatibilität der verschiedenen Bakterienarten zu testen (zB Wachstumstemperatur, Sauerstoffzufuhr, spezifischer Medien) zu berücksichtigen.
Unserem Assay kann auch verwendet werden, um auszuwerten, welches der T6SS Komponenten sind unbedingt erforderlich, da bereits Spuren von einem sekretierten Toxin könnte ausreichend sein, um die Beute zu töten. Auch schwache Aktivität der T6SS könnte dann deutlich von unseren Test nachgewiesen werden, dass Standard-Verfahren Tests T6SS-abhängige Sekretion mit Kulturüberstand und Western-Blot-VergleichAnalyse. Allerdings ist eine richtige koloniebildenden Einheit (CFU) Zählen noch für eine genaue Quantifizierung dieses T6SS Aktivität erforderlich.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Wellcome Trust Gewährung WT091939MA finanziert. Alain Filloux wird von der Royal Society unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
References
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