Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor
Summary
We beschrijven een kwalitatieve test voor bacteriële concurrentie gemedieerd door de monitor<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Type VI secretie systeem (T6SS). De assay is gebaseerd op de overleving / doden van Escherichia coli die een doelcellen<em> LacZ</em>-Reporter. Deze techniek is aan te passen aan de bactericide / bacteriostatisch activiteit van T6SS-bekwame micro-organismen te beoordelen.
Abstract
Type VI secretiesystemen (T6SSs) zijn moleculaire nanomachines waardoor Gram-negatieve bacteriën te transporteren en eiwitten injecteren in een grote verscheidenheid van doelwitcellen 1,2. De T6SS bestaat uit 13 kerncomponenten en geeft structurele overeenkomsten met de staart-buis van bacteriofagen 3. De faag gebruikt een buis en een doorprikkend apparaat om de celenvelop van doelbacteriën dringen en injecteer DNA. Voorgesteld wordt de T6SS een omgekeerde bacteriofaag inrichting creëren van een bepaald pad in de bacteriële cel envelop effectors en toxinen rijden naar het oppervlak. Het proces kan worden voortgezet en de T6SS apparaat kan perforeren andere cellen waarmee de bacterie in contact, waardoor het injecteren van de effectoren in deze doelen. De staart buis en doorprikken onderdelen van het apparaat van de T6SS zijn gemaakt met Hcp en VgrG eiwitten, respectievelijk 4,5.
De veelzijdigheid van de T6SS is aangetoond door middel van studies met verschillende bacteriële pathogenen. De Vibrio cholerae T6SS kan remodelleren het cytoskelet van eukaryote gastheercellen door het injecteren van een "ontwikkelde" VgrG die een C-terminale actine verknoping domain 6,7. Een ander opvallend voorbeeld is recent gedocumenteerd met behulp van Pseudomonas aeruginosa, die in staat is om te richten en bacteriën te doden in een T6SS-afhankelijke manier, dus het bevorderen van de oprichting van bacteriën in specifieke microbiële niches en concurrentiële omgeving 8,9,10.
In het laatste geval zijn drie T6SS afgescheiden eiwitten, namelijk Tse1, Tse2 en tse3 geïdentificeerd als de toxinen geïnjecteerd in de beoogde bacteriën (Figuur 1). De donorcel wordt beschermd tegen de nadelige gevolgen van deze effectoren via een anti-toxine mechanisme gemedieerd door de Tsi1, Tsi2 en Tsi3 immuniteit eiwitten 8,9,10. Deze antimicrobiële activiteit kan worden gecontroleerd wanneer T6SS-bekwame bacteriën worden samen geteeld op sOlid oppervlakken in concurrentie met andere bacteriesoorten of met T6SS-inactieve bacteriën van dezelfde soort 8,11,12,13.
Uit de beschikbare gegevens benadrukt een numerieke benadering van de bacteriële concurrentie assay, met inbegrip van tijdrovende CFU tellen die sterk afhankelijk is van antibiotica makers. In het geval van antibiotica resistente stammen zoals P. aeruginosa, kan deze methoden niet geschikt zijn. Bovendien, met de identificatie van ongeveer 200 verschillende T6SS loci in meer dan 100 bacteriële genomen 14 een geschikte screening instrument is zeer wenselijk. Wij een assay die gemakkelijk te gebruiken en vereist standaard laboratorium materialen en reagentia. De methode biedt een snelle en goede techniek om de T6SS-afhankelijke bactericide / bacteriostasis activiteit te controleren met een reporter-stam als een prooi (in dit geval Escherichia coli DH5a) waardoor a-complementatie van de lacZ gen. Algemeen is deze methode graphic en maakt een snelle identificatie van T6SS-verwante fenotypes op agar platen. Dit experimentele protocol kan worden aangepast aan andere stammen of bacteriële species met inachtneming van specifieke aandoeningen zoals groeimedia, temperatuur of tijd van contact.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die in dit artikel staat een visuele waarneming van T6SS-gemedieerde bactericide / bacteriostatisch activiteit. De test wordt uitgevoerd op het oppervlak van een agarplaat. Eerder is aangetoond dat T6SS afhankelijk doden assay uitgevoerd met gemengde bacteriële vloeibare cultuur niet efficiënt, waarschijnlijk door een gebrek aan constante contact tussen de twee bacteriën 8. De T6SS wordt verondersteld te werken met een mechanisme vergelijkbaar met degene die door bacteriofagen om DNA te injecteren in doelcellen 17. In vloeibare kweek, de buisvormige structuur van de T6SS kan gemakkelijker breken, kan inter-bacteriële contact verloren en de toxinen niet efficiënt leveren.
In termen van incubatietijden, de 5 eerste uren van contact dat we beschrijven tussen de donor stam en de prooi voldoende zijn om bacteriële doden tussen P. acht te nemen aeruginosa en E. coli, zoals geïllustreerd in figuur 3 </strong>. Niettemin is het raadzaam om de incubatietijd te passen door het uitvoeren van een kinetische om de experimentele omstandigheden te optimaliseren.
Aangezien deze methode een kleur gebaseerde techniek kan de uitgang resultaten worden beïnvloed door de pigmentatie van de donor stam. Bijvoorbeeld in het geval van P. aeruginosa, sommige stammen produceren hoge niveaus van gekleurde pigmenten zoals pyocyanin en pyoverdine, die kunnen interfereren met de bepaling uitlezing, zodat het verschil van de prooi relatief moeilijk. Andere chromogene substraten β-galactosidase, zoals de magenta-gal of rood-gal, worden gebruikt in plaats van de X-gal (tabel 1).
De competitiebepaling kan gebruik maken van andere reportergenen de uitlezing. Zo heeft overeenkomstige test ook uitgevoerd met groen fluorescent eiwit gemerkt prooien 12.
De assay, terwijl niet kwantitatieve geeft een goede indicatiede T6SS activiteit omdat het gebaseerd is op de overleving of het doden van een reporter prooi. Deze techniek heeft het voordeel dat het gemakkelijk en snel de bactericide / bacteriostasis activiteit van T6SSs evalueren van elke bacteriële species. Tot dusver is de activiteit van de T6SS is aangetoond tegen Gram-negatieve bacteriën en geen duidelijke voorbeeld van T6SS-gevoelige Gram-positieve bacteriën is gemeld nog 12. Het is ook duidelijk dat onverenigbaarheid in de cultuur van de verschillende bacteriesoorten te testen (bijv. groeitemperatuur, oxygenatie, specifieke media) moet worden beschouwd.
De test kan ook worden gebruikt om te evalueren welke T6SS componenten absoluut noodzakelijk omdat zelfs sporen van een uitgescheiden toxine kan volstaan om de prooi te doden. Zelfs zwakke activiteit van het T6SS kan dan duidelijk worden vastgesteld door ons assay vergeleken met standaard procedure testen T6SS-afhankelijke secretie met kweeksupernatant en western blotanalyse. Echter een goede kolonievormende eenheid (CFU) tellen blijft voor accurate kwantificering van deze T6SS activiteit.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust subsidie WT091939MA. Alain Filloux wordt ondersteund door de Royal Society.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?. BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. . Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
