T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

1。菌株と文化 （標準CaCl 2の治療またはエレクトロポレーションを用いて）15 大腸菌を形質転換することにより大腸菌受容細胞を（餌、P）のエンジニア大腸菌lacZ遺伝子（ 表1）の相補性を可能にするプラスミドとDH5α細胞。プレート40 mg / mlの最終濃度と適切な抗生物質で、5 – ブロモ-4 – クロロ – インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを含有するルリア – ベルターニ寒天プレート上で形質転換された細胞（LBA、1.5％寒天）（X-gal）を。 37℃で一晩、翌朝（§1.3参照）青形質転換体を選択。 T6SS活性である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ドナー細胞を成長させる（D +）またはT6SS不活性（D）（表1）一晩、LBAで37℃この例では、我々はPを使用ここで提示緑膿菌RETSは所持ひずみ恒常的に活性なH1-T6SS 16およびH1-T6SS遺伝子クラスター（ 表1）の欠失を持つ同質遺伝子変異。 翌日、 大腸菌のうち、明るい青色のクローンを接種することにより通気フラスコ中で一晩培養液を準備プレートからの形質転換体（P）は、適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス（TSB）5mlに、§1.1で説明した。 37℃で攪拌下で育つ℃、 §1.2で説明したプレートから- （D）（D +）との単一のコロニーを均等に進みます。 2。競合アッセイ翌日、実験のためのLBAプレートを準備します。これらのプレートが適切に（ブンゼンバーナーの近くや層流キャビネット内のいずれか）を乾燥させていることを確認します。株について"アッセイ入力"（入力）プレートを準備します（D +）、（D – ）、および（P </strong>）。 "アッセイ-出力"（出力）菌株用のプレートを準備します（ – D + P）と（D + P）。分割し、それに応じてプレートにラベルを付けます。 一晩増殖させた後（§1.3参照）、入力細菌培養（ – D、D +とP）の光学密度（OD 600nmの ） を測定し、各菌株の1単位OD 600nmの細胞密度に相当を取得するために必要な量を計算し。それぞれの"入力"細胞培養（D – 、D +とP）が最初に滅菌1.5mlエッペンドルフチューブに回収されています。 室温で1分間に13,000 rpmで細菌サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。 、D +と新鮮なTSBの100μlのP文化、穏やかにピペッティングし、各対応の10ミリリットルを接種- Dのペレットを再懸濁し"A入力"プレート（§2.1で調製したもの）上の単一のスポットとしてひずみをsponding。 "A-出力"プレート（§2.1で調製）接種する。 2つの別々のエッペンドルフチューブ（使用する文化がそれらの§2.4で説明されていることに注意）で30ミリリットル（P）と-より正確には、静かに30μlの（P）および30μlの（D）と（D +）30μlを混ぜる。ミックス（D + / P）の20μlを接種すると、（D – A / P） "出力"プレート上の個々のスポットとして。スポットが近くブンゼンバーナーを乾燥や細菌の殺害が行われている間、適切な期間を37℃のインキュベーターでプレートを配置することができます。 Pの場合にはT6SS欠損株を持つアクティブT6SSを比較するときに緑膿菌 、効率的な殺菌を5時間のインキュベーション後に観察される。 3。 tの定性的観察彼殺菌アッセイの読み出しのための40μg/ mlのX-galを含むLBAのプレートを準備します。プレートは、混合細菌文化を発見し、こうして殺し性能を読んで "読み出し入力"または "R入力"単離された細菌を発見するか、または "読み出し出力"または "R-出力"と呼ばれるでしょう。これらのプレートはきちんと乾燥させることも必要です。その裏に4等分にプレートを分割して0、10 -1、10 -2、10 -3、これらの部 ​​分に注釈を付け、（§3.3参照）寒天プレート上のスポットに細菌培養物の希釈物を指定する。希釈は、同じスポット内の青/白バクテリア比の半定量的評価が可能になります。 "入力"プレート（§2.4参照）から滅菌ループ個々の細菌スポットと "出力"プレート（§2.5参照）を用いて収集し、TSBの1ミリリットルを含む別個の1.5mlエッペンドルフチュー​​ブ内の各スポットを再懸濁します。効率的に再懸濁するために30分間エッペンドルフシェーカーブロックに置き細菌。 TSBの900μlを含む5回3エッペンドルフ管のシリーズを準備して、最大10 -3〜10倍段階希釈液に再懸濁した各スポットのために進んでください。ピペットチップを変更し、各希釈段階の間に渦を5秒にしてください。 、無希釈懸濁液に最も希釈始まるまでに40μg/ mlのX-galを含むよく乾燥したLBAのプレート上に§3.3で調製したあなたの細菌の希釈液のスポッティング "のためにこれらの" R入力 "プレートを作るに進みます入力"スポットと" A-出力"スポット（ 図2）R出力"のプレート"。均質細菌懸濁液を維持するためにスポッティングに進む前に、簡単に渦各チューブを。結果の再現性については、象限内の三連でスポット20μlを（ 図2）。スポットが個別にプレート上で分離し、互いに向かって滑空しないままにする必要があるので、お皿の相対的乾燥度は、この段階では重要である。競合アッセイの定量化は、実験のこの段階でも可能です。ステップ3.3に続いて、40μg/ mlのX-galを含むプレート上のLBA 10 -3希釈液100μlを広げた。結果の再現性については、 "出力"プレートから各スポットについて三重のめっきに進みます。 ℃インキュベーターで一晩（16時間のインキュベーションに相当）は37に希釈プレートを置きます。青色のコロニー（生き残っP細胞）のカウントに進みます。競争の5時間後に得られた典型的な結果を図3に示します。 各スポット内に過剰の液体の吸収を可能にするために、無菌ゾーン内プレートオープン（NO蓋）のままにします。 一晩37℃のインキュベーターでプレートを置きます。このインキュベーション時間の間に、殺害はまだ両方の株が接触して残っているので、（D + / P）をミックスで発生している。 写真を撮るまたは出力の分析（ 図2）のためのあなたのプレートをスキャンしてください。スポットは大部分が青のままそれはどこにいることを示し、E.大腸菌はPによって殺されていない緑膿菌 。それがそうであるときに、E.大腸菌は T6SS欠陥のPで混合される緑膿菌株 （D）（図2、右下のプレート）。