A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي
Summary
نحن تصف مقايسة لمراقبة النوعية البكتيرية المنافسة بوساطة<em> الزائفة الزنجارية</em> إفراز VI نظام نوع (T6SS). الفحص يعتمد على بقاء / قتل الخلايا القولونية القولونية الهدف يحمل<em> lacZ</em> مراسل-. هذه التقنية هو قابل للتعديل لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SS-يتقن الكائنات الحية الدقيقة.
Abstract
نظم إفراز نوع السادس (T6SSs) هي هذه التقنية الجزيئية تسمح الجراثيم سلبية الغرام لنقل وحقن البروتينات إلى مجموعة واسعة من 1،2 الخلايا المستهدفة. ويتألف من المكونات الأساسية T6SS 13 و يعرض أوجه التشابه الهيكلي مع أنبوب الذيل من البكتيريا 3. فإن الفيروس يستخدم أنبوب وجهاز ثقب لاختراق الغلاف خلية من البكتيريا المستهدفة وحقن الحمض النووي. يقترح أن T6SS هو جهاز عاثية مقلوب خلق مسار معين في المغلف الخلية البكتيرية لدفع المستجيبات والسموم إلى السطح. يمكن أن تؤخذ في عملية أخرى، ويمكن الجهاز T6SS خرم الخلايا الأخرى التي البكتيريا على اتصال، وبالتالي ضخ والمستجيبات في هذه الأهداف. يتم إجراء أنبوب الذيل وأجزاء الجهاز تعطيب من T6SS مع المندوبية والبروتينات VgrG، على التوالي 4،5.
وقد أظهرت براعة من خلال ليالي T6SStudies باستخدام مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة. يمكن للالكوليرا الضمة T6SS يعيد الهيكل الخلوي للخلايا حقيقية النواة المضيف عن طريق حقن و"تطورت" VgrG يحمل الأكتين C-محطة عبر ربط المجال 6،7. وقد تم توثيق مؤخرا ضرب مثالا آخر باستخدام الزائفة الزنجارية التي هي قادرة على استهداف وقتل البكتيريا بطريقة T6SS التي تعتمد على، وتعزيز ذلك بإنشاء البكتيريا في بيئات محددة والميكروبية بيئة تنافسية 8،9،10.
في الحالة الأخيرة، تم تحديد ثلاث T6SS-يفرز البروتينات، وهي Tse1، وTse2 Tse3 والسموم حقن البكتيريا في الهدف (الشكل 1). محمي الخلية المانحة من تأثير ضار من هذه المستجيبات عبر آلية مكافحة السم، بوساطة بروتينات المناعة Tsi1، وTsi2 Tsi3 8،9،10. ويمكن رصد هذا النشاط البكتيري عند T6SS-يتقن البكتيريا شارك في زراعتها على قشهيد السطوح في منافسة مع الأنواع البكتيرية الأخرى أو مع T6SS خاملا البكتيريا من نفس النوع 8،11،12،13.
وأكد أن البيانات المتاحة نهج العددية للفحص الجرثومي المنافسة، بما في ذلك عد CFU تستغرق وقتا طويلا أن تعتمد إلى حد كبير على واضعي المضادات الحيوية. في حالة السلالات المقاومة للمضادات الحيوية مثل P. الزنجارية، يمكن لهذه الأساليب أن يكون غير لائق. وعلاوة على ذلك، مع تحديد مواضع مختلفة نحو 200 T6SS في أكثر من 100 الجينوم البكتيري 14، أداة فحص ملاءمة هو مرغوب فيه للغاية. وضعنا مقايسة التي هي سهلة الاستخدام ويتطلب معيار المواد المختبرية والكواشف. الأسلوب يوفر تقنية سريعة ونوعية لمراقبة نشاط T6SS التي تعتمد على جراثيم / الجراثيم باستخدام سلالة مراسل بوصفه ضحية (في هذه الحالة كولاي DH5α) السماح لتكامل-lacZ من الجين. وعموما، هذا الأسلوب هو العنبالتحالف الدولي للموئل ويسمح التحديد السريع للT6SS الظواهر ذات الصلة على لوحات أجار. يمكن تكييفها هذا البروتوكول التجريبي لسلالات أخرى أو الأنواع البكتيرية مع مراعاة الظروف الخاصة مثل وسائط النمو، درجة الحرارة أو وقت الاتصال.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب في هذه المقالة يسمح الملاحظة البصرية للنشاط جراثيم T6SS بوساطة / الجراثيم. يتم تنفيذ الفحص على سطح لوحة أجار. ولقد ثبت في وقت سابق ان T6SS التي تعتمد على فحص أداء قتل مع مختلطة ثقافة البكتيرية السائلة ليست فعالة، من المحتمل بسبب عدم وجود اتصال مستمر بين البكتيريا السابقتين 8. ويعتقد أن T6SS للعمل مع آلية شبيهة لتلك المستخدمة من قبل البكتيريا لحقن الحمض النووي في الخلايا المستهدفة 17. في الثقافة السائلة، وهيكل أنبوب يشبه من T6SS قد كسر بسهولة أكبر، ويمكن أن تضيع بين البكتيرية الاتصال، لا يتم تسليم والسموم بكفاءة.
من حيث أوقات الحضانة، و5 ساعات الأولي من الاتصال التي وصفنا بين سلالة المانحة والقتيل كافية لمراقبة قتل البكتيريا P. بين الزنجارية وE. القولونية، كما هو موضح في الشكل (3) </strong>. ومع ذلك، فإنه من المستحسن لضبط الوقت عن طريق إجراء الحضانة الحركية من أجل تحسين الظروف التجريبية.
منذ هذا الأسلوب هو أسلوب يستند إلى لون ويمكن أن تتضرر النتائج التي خرج تصبغ في سلالة المانحة. على سبيل المثال، في حالة P. الزنجارية، وبعض سلالات إنتاج مستويات عالية من المواد الملونة الملونة مثل بايوسيانين وpyoverdine، والتي يمكن أن تتداخل مع قراءات الفحص، مما يجعل تمييز من الصعب نسبيا فريسة. ويمكن استخدام مولد اللون β-الأخرى غالاكتوزيداز ركائز، مثل غال غال أرجواني أو أحمر، بدلا من X-غال (الجدول 1).
يمكن للفحص المنافسة الاستفادة من الجينات الأخرى لمراسل قراءات. على سبيل المثال، كما تم فحص مماثلة أجريت باستخدام الفلورية الخضراء البروتين المسمى يفترس 12.
مقايسة لدينا، في حين لا الكمية، ويعطي مؤشرا جيداالنشاط T6SS لأنها مبنية على بقاء أو قتل فريسة مراسل. يقدم هذه التقنية ميزة كونها سهلة ومريحة لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SSs من أي نوع من الأنواع البكتيرية. وقد أبلغ حتى الآن، وقد تبين أن نشاط T6SS ضد البكتيريا سالبة الجرام وليس مثال واضح على البكتيريا إيجابية الجرام T6SS حساسة 12 حتى الان. ومن الواضح أيضا أن عدم التوافق في الثقافة من الأنواع البكتيرية المختلفة لاختبار (مثل النمو درجة الحرارة، والأوكسجين، وسائط معين) هو أخذها بعين الاعتبار.
ويمكن أيضا أن تستخدم لدينا فحص لتقييم أي من مكونات ضرورية للغاية T6SS منذ آثار مادة سامة حتى يفرز قد تكون كافية لقتل الفريسة. يمكن أن النشاط حتى ضعف واضح T6SS ثم يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص لدينا بالمقارنة مع مستوى إفراز الإجراء T6SS التي تعتمد على استخدام اختبار لطخة الثقافة طاف والغربيةالتحليل. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة لتشكيل مستعمرة السليم حدة (CFU) عد لالكمي الدقيق لهذا النشاط T6SS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم WT091939MA منحة الثقة. ويدعم آلان Filloux من قبل الجمعية الملكية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?. BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. . Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
