בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים
Summary
האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.
Abstract
האסטרוציטים הם סוג תא בשפע במוח של היונקים, עדיין נותרים הרבה מה ללמוד על המאפיינים המולקולריים ופונקציונליים שלהם. במערכות סלולריות תרבות astrocyte מבחנה יכול לשמש כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של תאי גליה אלה בפירוט. פרוטוקול וידאו זה מראה כיצד להשיג האסטרוציטים טהורים על ידי בידוד והתרבות של תאי קליפת מוח המעורבים של גורי עכברים. השיטה מבוססת על העדר נוירונים קיימא וההפרדה של האסטרוציטים, oligodendrocytes ומיקרוגלים, שלוש האוכלוסיות העיקריות גליה התאים של מערכת העצבים המרכזית, בתרבות. תמונות מייצגות בימים הראשונים של התרבות להדגים את נוכחותה של אוכלוסיית תאים מעורבת ומצביעות timepoint, כאשר האסטרוציטים הופכים confluent וצריך להיות מופרדים מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes. יתר על כן, אנו מדגימים טוהר ומורפולוגיה astrocytic של האסטרוציטים תרבית באמצעות stainings immunocytochemical למבוסס היטב ותאר חדש סמני astrocyte. מערכת זו התרבות יכולה לשמש בקלות להשיג האסטרוציטים עכבר טהורים ובינוני astrocyte ממוזג ללימוד היבטים שונים של ביולוגית astrocyte.
Introduction
האסטרוציטים הם סוג תא נפוץ מאוד במערכת העצבים המרכזית (CNS). היחס של האסטרוציטים לנוירונים הוא 1:03 בקליפת המוח של עכברים וחולדות, ואילו יש 1.4 האסטרוציטים לנוירון ב1 קליפת אדם. ריבית בתפקוד astrocyte גדלה באופן דרמטי בשנים האחרונות. תפקיד מרכזי של האסטרוציטים הוא תפקידם במתן תמיכה מבנית לנוירונים וטבולים 2,3. תפקידים חדשים שהתגלו להאסטרוציטים לכסות ספקטרום רחב של פונקציות. אלה כוללים מנחים ההגירה של האקסונים המתפתחים וneuroblasts המסוים במהלך הפיתוח 4-6, פונקציות בהעברה הסינפטית, כוח סינפסה ועיבוד מידע על ידי מעגלים עצביים 7-9, תפקידים במחסום דם מוח (BBB) היווצרות 10 ויושרה 11-13 ורגולציה של 14 טון כלי הדם במוח. תכונה בולטת נוספת של האסטרוציטים היא תגובתם לפציעה. תחת תנאי astrocyt פתולוגיes להיות תגובתי ועוד upregulate הביטוי של חלבון ביניים נימת גליה fibrillary חומצי (GFAP) ומטריצת החלבונים תאיים מעכבים (ECM) 15,16. האסטרוציטים תגובתי לתחום את הפגיעה באתר מהרקמה בריאה על ידי יצירת צלקת גלייה, המורכבת בעיקר מחלבונים מופרשים ECM astrocyte של סולפט כונדרואיטין משפחת גליקן (CSPG), הגורמים העיקריים המעכבים התחדשות axonal לאחר פציעת CNS 15-17.
האסטרוציטים מקורן תאי גלייה רדיאלי (RG) במהלך התפתחות עוברת מאוחר וחיים לאחר לידה מוקדמים. לאחר מפרט astrocyte התרחש, מבשרי astrocyte להגר למצבם הסופי, שבו הם מתחילים בתהליך של בידול מסוף. בחי, האסטרוציטים להיראות בוגר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר לידה כפי שצוינו על ידי המורפולוגיה האופיינית 18,19. תת אוכלוסיות של תאי RG להמיר לתוך האסטרוציטים אזור subventricular (סוג B תאים). Both, RG ותאים מסוג B לתפקד כתאי astrocyte דמוי גזע עצביים (NSCs) במהלך התפתחות ובמבוגרים, בהתאמה. כמו האסטרוציטים, RG ותאים מסוג B גם להביע טרנספורטר astrocyte הספציפי גלוטמט (GLAST), חלבון מוח שומנים מחייבים (BLBP), וGFAP, המציין כי סמנים אלה לא ניתן להשתמש באופן בלעדי במיוחד כדי לתייג את האסטרוציטים בוגרים. בניגוד להאסטרוציטים parenchymal מבוגרים, שאינם מחלקים במוח, RG הבריא ופוטנציאל הסוג B תאי תערוכת תאי גזע כגון יכולת עצמית לחדש. Dysregulation של האסטרוציטים היה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר 20,21, מחלת הנטינגטון 22, מחלת פרקינסון 23, 24 רט התסמונת ומחלתו של אלכסנדר 25. יתר על כן, האסטרוציטים להגיב לכל העלבונות של מערכת העצבים המרכזיים, מה שמוביל להפעלת astrocyte והיווצרות צלקת גלייה astrocytic 16,26. צלקת גלייה astrocytic שיוצרת מוח tr הבאפגיעה בחוט שדרה או auma נחשבת למכשול העיקרי המונע התחדשות תאי עצב 15.
הפיתוח של שיטות אמינות לבודד ולשמור על אוכלוסיות מטוהרות של תאים היה חיוני להבנה של מערכת העצבים שלנו. עבודתו החלוצית של מקארתי ודה Vellis מאפשרת לחוקרים למועד להכין תרבויות כמעט טהורות של האסטרוציטים מרקמות חולדת יילודי 27. רב כבר למד על ביולוגית astrocyte שימוש בשיטה זו, המוצגת כאן בצורה שונה מעט לבידוד האסטרוציטים קליפת המוח של עכברים. משלימים במחקרי vivo, האסטרוציטים, כמו גם מדיום מותנה הושג באמצעות תואר בתרבות מבחנה, הם כלים חשובים נוספת להבנה הטובה של פונקציות astrocyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מבוססת על הכנת תרבות astrocyte ממוח של ילוד מכרסם, שתואר לראשונה על ידי מקארתי ודה Vellis בשנת 1980 27. השיטה השונה של הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח מP1 לאחר הלידה למוח עכבר P4 מוצגת כאן הוא מהיר, תשואות האסטרוציטים ראשוניים וטהורים וניתן לשחזור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי קרן Fazit בוגרת המלגה לס"ס, המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF 01 איו 0803) לק"ג והנציבות האירופיים FP7 גרנט PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX, וקרן המחקר הגרמני גרנט SCHA 1442 / המחברים 3-1 לCS אין אינטרסים כלכליים סותרים.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
