Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты
Summary
Астроциты были признаны универсальными клетки, участвующие в фундаментальных биологических процессов, которые необходимы для нормального развития и функционирования мозга и центральной нервной системы ремонта. Здесь мы представляем быстрой процедуры получения чистых культур астроцитов мышь, чтобы изучать биологию этого важнейшего класса центральной нервной системы.
Abstract
Астроциты являются обильные типа клеток в мозге млекопитающих, однако еще многое предстоит узнать о их молекулярных и функциональных характеристик. Экстракорпоральное астроцитов системы культуры клеток могут быть использованы для изучения биологических функций этих клеток глии в деталях. Это видео показывает, как протокол для получения чистого астроцитов путем выделения и культуры смешанных корковых клеток мыши щенков. Метод основан на отсутствии жизнеспособных нейронов и разделение астроцитов, олигодендроцитов и микроглии, три основных глиальных популяций клеток центральной нервной системы, в культуре. Представитель изображений в первые дни культуры демонстрируют наличие смешанной популяции клеток и указать временной точке, когда астроциты стать вырожденной и должны быть отделены от микроглии и олигодендроцитов. Кроме того, мы демонстрируем чистоту и астроцитов морфологии культурного астроциты использованием иммуноцитохимических для окрашивания хорошо организованной иВновь описанный астроцитов маркеров. Эта культура система может быть легко использован для получения чистого астроциты мыши и астроцитов-кондиционированной среды для изучения различных аспектов астроцитов биологии.
Introduction
Астроциты являются очень обильные типа клеток в центральной нервной системе (ЦНС). Отношение астроцитов в нейроны составляет 1:3 в коре головного мозга мышей и крыс, тогда как в 1,4 астроциты на нейрон в коре человека 1. Интерес к функции астроцитов, резко возросло в последние годы. Ключевая функция астроцитов является их роль в обеспечении структурной и метаболической поддержки нейронов 2,3. Недавно обнаруженные роли астроцитов охватывает широкий спектр функций. Они включают в себя руководящие миграции развивающиеся аксоны и некоторых нейробластов в процессе разработки 4-6, функции в синаптической передачи, синапса сила и обработки информации с помощью нейронных цепей 7-9, роли в гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) формирование 10 и целостности 11-13 и регулирование цереброваскулярных 14 тон. Еще одна важная особенность астроцитов является их реакция на травму. При патологических условиях astrocytES стала реактивной и дальнейшее апрегулируются выражения промежуточных филаментов глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и тормозных внеклеточного матрикса (ECM) белки 15,16. Реактивная астроциты демаркации места повреждения от здоровых тканей за счет формирования глиальных рубцов, которая состоит в основном из астроцитов секретируемых белков ECM из хондроитина сульфата протеогликанов (CSPG) семьи, основные факторы, которые препятствуют регенерации аксонов после травм ЦНС 15-17.
Астроциты исходят от радиальной глии (РГ) клеток во время позднего эмбриогенеза и раннего послеродового жизни. После астроцитов спецификации произошло, астроцитов предшественники мигрируют в своей окончательной позиции, где они начинают процесс терминальной дифференцировки. В естественных условиях, астроциты, по всей видимости, зрелые три-четыре недели после рождения, как указано в их типичной морфологией 18,19. Субпопуляции клеток RG конвертировать в субвентрикулярной астроциты зоны (тип В-клеток). Сидр., RG и клетки типа B функционировать как астроциты, как нервные стволовые клетки (НСК) во время разработки и во взрослой, соответственно. Как астроциты, RG и клетки типа B также выразить астроцитов конкретных глутамата транспортер (GLAST), мозг липид-связывающий белок (BLBP), и GFAP, указывая, что эти маркеры не могут быть использованы исключительно в специально маркировать взрослых астроцитов. В отличие от взрослых паренхиматозных астроцитов, которые не разделяют в здоровом мозге, RG и типа В-клетки выставки стволовых клеток потенциал таких как способность к самообновлению. Нарушение регуляции астроциты были замешаны в многочисленных патологий, в том числе болезни Альцгеймера 20,21, болезнь Хантингтона 22, болезнь Паркинсона 23, синдромом Ретта 24 и болезнь Александра 25. Кроме того, астроциты реагируют на все оскорбления со стороны ЦНС, что приводит к активации астроцитов и глиальных астроцитов формирование рубца 16,26. Астроцитарных глиальных рубцов, которая формирует следующие TR мозгаAUMA или повреждением спинного мозга считается главным барьер, препятствующий регенерации нейронов 15.
Разработка надежных методов, чтобы изолировать и поддерживать очищенной популяции клеток было важно для нашего понимания нервной системы. Пионерские работы по Маккарти и де Vellis позволяет исследователям до сих подготовить почти чистых культурах астроцитов из ткани новорожденных крыс 27. Многое узнал о астроцитов биологии с использованием этого метода, который представлен здесь в несколько измененной форме выделения мышью корковых астроцитов. В дополнение в естественных условиях исследования, астроциты, а также кондиционированной среды, полученные с использованием описанного в культуре пробирке, являются ценными инструментами для дальнейшего получить представление астроцитов функций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методом, описанным здесь, основаны на астроциты подготовки культуру от грызунов новорожденных мозг, первоначально описанный Маккарти и де-Vellis в 1980 27. Модифицированный метод выделения и культуры корковых астроциты от послеродовой P1 до P4 мозга мыши, представленные здесь, быстро, д?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается Fazit Foundation Graduate Fellowship СС, Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF 01 ЭО 0803) в КБ и Европейской комиссией FP7 Грант PIRG08-GA-2010-276989, Neurex и Немецкого научно-исследовательского гранта Фонда Ща 1442 / 3-1 в CS авторы не имеют противоречивые финансовые интересы.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
