العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية
Summary
وقد تم الاعتراف الخلايا النجمية لتكون خلايا تنوعا المشاركة في العمليات البيولوجية الأساسية التي لا غنى عنها لنمو الدماغ الطبيعي وظيفة، ووسط إصلاح الجهاز العصبي. هنا نقدم إجراء سريع للحصول على الثقافات نقية نجمية الماوس لدراسة علم الأحياء من هذه الفئة الرئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
الخلايا النجمية هي نوع من الخلايا وفرة في أدمغة الثدييات، ولكن لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن خصائصها الجزيئية والوظيفية. في أنظمة نجمية المختبر زراعة الخلايا يمكن استخدامها في دراسة الوظائف البيولوجية لهذه الخلايا الدبقية بالتفصيل. هذا البروتوكول الفيديو يوضح كيفية الحصول على الخلايا النجمية نقية من العزلة والثقافة من الخلايا القشرية مختلطة من الجراء الماوس. وتستند هذه الطريقة على عدم وجود الخلايا العصبية قابلة للحياة وفصل oligodendrocytes قد، والخلايا النجمية الخلايا الدبقية الصغيرة، والثلاثة الرئيسية من السكان الخلية الدبقية في الجهاز العصبي المركزي، في الثقافة. صور ممثل خلال الأيام الأولى للثقافة إثبات وجود السكان الخلية المختلطة وبيان timepoint، عندما تصبح الخلايا النجمية متكدسة ويجب أن يتم فصل الخلايا الدبقية الصغيرة من و oligodendrocytes. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن النقاء ومورفولوجيا الخلايا النجمية من نجمي مثقف باستخدام stainings immunocytochemical لراسخة ووصف علامات نجمية حديثا. ويمكن هذا النظام الثقافة استخدامها بسهولة للحصول على الخلايا النجمية الماوس نقية والمتوسطة نجمية مكيفة لدراسة مختلف جوانب البيولوجيا نجمية.
Introduction
الخلايا النجمية هي نوع من الخلايا وفيرة جدا في الجهاز العصبي المركزي (CNS). نسبة الخلايا النجمية لالخلايا العصبية هو 01:03 في القشرة من الفئران والجرذان، في حين هناك 1.4 الخلايا النجمية في الخلايا العصبية في القشرة الإنسان 1. وقد زاد الاهتمام في وظيفة الخلايا النجمية بشكل كبير في السنوات الأخيرة. إحدى الوظائف الرئيسية للالنجمية هو دورها في توفير الدعم الهيكلي والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية 2،3. الأدوار المكتشفة حديثا عن الخلايا النجمية تغطي طيف واسع من الوظائف. وتشمل هذه الهجرة من توجيه محاور عصبية النامية وneuroblasts معينة خلال التنمية 4-6، وظائف في انتقال متشابك، المشبك القوة ومعالجة المعلومات من قبل الدوائر العصبية 7-9، في أدوار حاجز الدم في الدماغ (BBB) تشكيل (10) وسلامة 11-13 وتنظيم ال 14 لهجة الدماغية. ميزة أخرى كبيرة من الخلايا النجمية هو استجابتها للإصابة. تحت astrocyt الحالات المرضيةأصبح وفاق رد الفعل وupregulate مزيد من التعبير عن البروتين المتوسطة الدبقية خيوط لييفي الحمضية (GFAP) والمثبطة البروتينات خارج الخلية المصفوفة (ECM) 15،16. الخلايا النجمية على رد الفعل ترسيم موقع الإصابة من الأنسجة السليمة من خلال تشكيل ندبة الدبقية، التي تتكون بشكل رئيسي من البروتينات نجمية ECM يفرز من عائلة كبريتات شوندروتن (CSPG) بروتيوغليكان، العوامل الرئيسية التي تحول دون تجدد المحاور بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي 15-17.
الخلايا النجمية تنشأ من الخلايا الشعاعية (RG) الدبقية خلال مرحلة التطور الجنيني في وقت متأخر بعد الولادة والحياة في وقت مبكر. بعد تحديد نجمية حدث والسلائف نجمية الهجرة إلى مواقعها النهائية، حيث تبدأ عملية التمايز النهائي. في الجسم الحي، ويبدو أن الخلايا النجمية تكون ناضجة ثلاثة إلى أربعة أسابيع بعد الولادة كما أشارت إلى ذلك التشكل على 18،19 نموذجية. جزء من السكان من الخلايا النجمية RG تحويلها إلى منطقة subventricular (نوع B الخلايا). Bأوراسكوم تليكوم القابضة، والخلايا B RG نوع وظيفة ونجمية مثل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) خلال التنمية وفي البالغين، على التوالي. مثل RG، الخلايا النجمية والخلايا B نوع أيضا تعبر عن نقل الغلوتامات نجمية محددة (GLAST) والدماغ الدهون ملزم البروتين (BLBP)، وGFAP، مشيرا إلى أن هذه العلامات لا يمكن أن تستخدم حصرا لتسمية الخلايا النجمية على وجه التحديد الكبار. وعلى النقيض من الخلايا النجمية متني الكبار، التي لا تفرق في RG صحية والدماغ والخلايا B نوع المعرض الجذعية المحتملة الخلية مثل القدرة على تجديد الذات. وقد تورط dysregulation من الخلايا النجمية في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر 20،21، مرض هنتنغتون 22، مرض باركنسون 23، متلازمة ريت 24 و المرض الإسكندر 25. وعلاوة على ذلك، الخلايا النجمية الرد على جميع الإهانات من CNS، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا النجمية ونجمي تشكيل ندبة الدبقية 16،26. ندبة الدبقية التي تشكل نجمي التالية TR الدماغويعتقد أوما أو اصابات الحبل الشوكي لتكون حاجزا منع تجديد الخلايا العصبية الوزراء 15.
وقد تم تطوير طرق موثوقة لعزل السكان والحفاظ على تنقية الخلايا ضرورية لفهمنا للجهاز العصبي. العمل الرائد من قبل مكارثي وتمكن المحققون دي Vellis حتى الآن لإعداد الثقافات نقية تقريبا من الخلايا النجمية من الأنسجة الفئران حديثي الولادة 27. وقد تعلمت الكثير عن علم الأحياء نجمية باستخدام هذا الأسلوب، الذي يقدم هنا في شكل معدل قليلا لعزل الخلايا النجمية الماوس القشرية. استكمال الدراسات المجراة في، الخلايا النجمية وكذلك المتوسطة مكيفة تم الحصول عليها باستخدام وصفها في الثقافة المختبر، هي أدوات قيمة للحصول على مزيد من نظرة ثاقبة وظائف نجمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستند هذه الطريقة المذكورة هنا على إعداد ثقافة نجمية من أدمغة القوارض حديثي الولادة، وصفت في الأصل من قبل مكارثي وVellis دي في عام 1980 27. طريقة معدلة من العزلة وثقافة الخلايا النجمية القشرية من الدماغ إلى ما بعد الولادة P1 الماوس P4 المقدمة هنا هو سريع، والمحاصيل ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من زمالة دراسات عليا Fazit مؤسسة لSS، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحث العلمي (BMBF 01 EO 0803) لKB والمفوضية الأوروبية FP7-المنح PIRG08 GA-2010-276989، NEUREX، ومؤسسة البحوث الألمانية المنح SCHA 1442 / 3-1 لCS الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة المالية.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
