Summary

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Published: January 19, 2013
doi:

Summary

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Abstract

Astrocyten een overvloedige celtype in de hersenen van zoogdieren, maar nog veel te leren over de moleculaire en functionele eigenschappen. In vitro astrocyten celculturen kunnen worden gebruikt om de biologische functies van deze gliacellen in detail te onderzoeken. Deze video protocol toont hoe zuivere astrocyten verkrijgen door het kweken van gemengde corticale cellen van muis pups. De methode is gebaseerd op de afwezigheid van levensvatbare neuronen en de scheiding van astrocyten, oligodendrocyten en microglia, de drie gliale celpopulaties van het centraal zenuwstelsel, in cultuur. Representatieve beelden tijdens de eerste dagen kweken de aanwezigheid van een gemengde celpopulatie en dan het tijdpunt bij astrocyten worden confluent en te scheiden van microglia en oligodendrocyten. Bovendien tonen we aan zuiverheid en astrocytaire morfologie van gekweekte astrocyten met behulp van immunocytochemische kleuringen voor goed ingeburgerd ennieuw beschreven astrocyten markers. Deze cultuur systeem kan gemakkelijk worden gebruikt om zuivere muis astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium te verkrijgen voor het bestuderen van verschillende aspecten van de astrocyten biologie.

Introduction

Astrocyten een zeer overvloedig celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). De verhouding van astrocyten om neuronen is 1:3 in de cortex van muizen en ratten, terwijl er 1,4 astrocyten per neuron in de menselijke cortex 1. Interesse in astrocyten functie is dramatisch toegenomen in de afgelopen jaren. Een belangrijke functie van astrocyten is hun rol bij het ​​verlenen van structurele en metabole steun aan neuronen 2,3. Nieuw ontdekte rollen voor astrocyten bestrijken een breed spectrum van functies. Deze omvatten het geleiden van de migratie van ontwikkeling axonen en bepaalde neuroblasten tijdens de ontwikkeling 4-6, functies in synaptische transmissie, synaps sterkte en informatieverwerking door neurale circuits 7-9, rollen in bloed-hersen barrière (BBB) ​​vorming 10 en 11-13 integriteit en regulering van de cerebrovasculaire toon 14. Een ander belangrijk kenmerk van astrocyten is hun reactie op letsel. Onder pathologische omstandigheden astrocytes worden reactief en verder opreguleren de expressie van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure proteïne (GFAP) en remmende extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 15,16. Reactieve astrocyten bakenen de schade site van gezond weefsel door vorming van een gliale litteken, die voornamelijk bestaat uit astrocyten afgescheiden ECM-eiwitten van de chondroïtinesulfaat proteoglycan (CSPG) familie, de belangrijkste factoren die een remmende axonale regeneratie na CNS verwonding 15-17.

Astrocyten afkomstig uit radiale glia (RG) cellen tijdens de late embryogenese en de vroege postnatale leven. Na astrocyten specificatie opgetreden, astrocyten precursoren migreren hun eindposities, waar het proces van terminale differentiatie beginnen. In vivo, astrocyten lijken mature drie tot vier weken na de geboorte zoals aangegeven door hun typische morfologie 18,19. Een subpopulatie van cellen RG zetten in subventriculaire zone astrocyten (type B-cellen). Both, RG en type B cellen functioneren als astrocyten zoals neurale stamcellen (NSC's) tijdens ontwikkeling en in het volwassen respectievelijk. Net als astrocyten, RG en type B-cellen ook uitdrukking van de specifiek in de astrocyten glutamaat transporter (GLAST), hersenen lipide-bindend eiwit (BLBP) en GFAP, wat aangeeft dat deze markers niet kunnen uitsluitend worden gebruikt om specifiek te labelen volwassen astrocyten. In tegenstelling tot volwassen parenchymale astrocyten, die niet delen in de gezonde hersenen, RG en type B cellen vertonen stamcel potentieel, zoals het vermogen om zichzelf te vernieuwen. Ontregeling van astrocyten is betrokken bij talrijke ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer 20,21, de ziekte van Huntington 22, Parkinson 23, Rett-syndroom 24 en Alexander de ziekte 25. Bovendien astrocyten reageren op alle beledigingen van het CNS, wat leidt tot activatie en astrocyten astrocytische gliale littekenvorming 16,26. De astrocytaire gliale litteken dat volgende hersenen tr vormtAUMA of het ruggenmerg letsel wordt gedacht dat de belangrijkste belemmering voor neuronale regeneratie 15 zijn.

De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te handhaven gezuiverde populaties van cellen is essentieel voor het begrip van het zenuwstelsel. Pionierswerk door McCarthy en de Vellis stelt onderzoekers tot nu toe tot bijna zuivere culturen van astrocyten te bereiden van neonatale rat weefsel 27. Er is veel geleerd over astrocyten biologie met behulp van deze methode, die hier wordt gepresenteerd in een licht gewijzigde vorm voor het isoleren van de muis corticale astrocyten. Aanvulling in vivo studies, astrocyten en geconditioneerd medium verkregen met de beschreven in vitro cultuur waardevolle hulpmiddelen om verder inzicht te krijgen in astrocyten functies.

Protocol

1. Isolatie en Plating van Mixed corticale cellen Gemengde corticale cel isolatie voor astrocyten culturen kunnen worden uitgevoerd met behulp van P1 tot P4 muis pups. Om een ​​daadwerkelijke astrocyten dichtheid moet gebruiken 4 mouse pup cortices per T75 weefselkweekfles. Daarom worden in de volgende volumes protocol berekend voor een celpreparaat met 4 mouse pups. Alvorens de dissectie procedure voorverwarmen 30 ml astrocyten kweekmedium (DMEM, hoge glucose + 10% met warmte…

Representative Results

Na isolatie van de volledige muizenhersenen (Figuur 1A), het cerebellum en de reukkwabben worden verwijderd (Figuur 1B). De cortices worden gepeld van de muis hersenstam (figuur 1C) en hersenvliezen van de individuele cortex (figuur 1D) zorgvuldig wordt verwijderd (figuur 1E). Hersenvliezen duidelijk door de meningeale slagader systeem en onvolledige verwijdering resulteert in verontreiniging van de uiteindelijke astrocyten cultuur door…

Discussion

De hier beschreven werkwijze is gebaseerd op de astrocyt preparaat van neonatale hersenen van knaagdieren, oorspronkelijk beschreven door McCarthy en de Vellis in 1980 27. De aangepaste methode van de isolatie en de cultuur van corticale astrocyten van postnatale P1 tot P4 hersenen van muizen die hier is snel, levert zuivere primaire astrocyten en is zeer reproduceerbaar. Deze techniek kan eenvoudig worden overgedragen naar astrocyten isoleren van andere soorten, zoals van de rat en varken en andere hersengeb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ondersteund door de Fazit Foundation Graduate Fellowship om SS, het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF 01 EO 0803) aan KB en de Europese Commissie KP7 Subsidieovereenkomst PIRG08-GA-2010 tot 276,989, NEUREX, en de Duitse Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 van CS De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Materials

Name of working solution Company Catalogue number Final concentration
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose Life Technologies 31966-021
FBS, heat-inactivated Life Technologies 10082-147 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 Final Concentration: 1%
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2.5% Trypsin Life Technologies 15090-046 Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E 50 μg/ml
Water PAA S15-012 cell culture grade
PBS PAA H15-002 cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-062
0.45 μm Sterile filter Sartorius 16555
3.5 cm petri dish BD Falcon 353001
15 ml Falcon tube BD Falcon 352096
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
75 cm2 Tissue culture flask BD Falcon 353136
Forceps, fine Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Stereomicroscope Leica MZ7.5
Stereomicroscope + Camera Leica MZ16F; DFC320
Microscope + Camera Zeiss; Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
Water bath Julabo SW20; 37 °C

References

  1. Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
  2. Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
  3. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
  4. Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
  5. Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
  6. Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  7. Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
  8. Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
  9. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
  10. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
  11. Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
  12. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  13. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
  14. Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
  15. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
  16. Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
  17. Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
  18. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
  19. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
  20. Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
  21. Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
  22. Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
  23. Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
  24. Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
  25. Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
  26. Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
  27. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  28. Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
  29. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  30. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
  31. Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
  32. Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
  33. Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
  34. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  35. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
  36. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).

Play Video

Cite This Article
Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079, doi:10.3791/50079 (2013).

View Video