Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.
Astrocyten een overvloedige celtype in de hersenen van zoogdieren, maar nog veel te leren over de moleculaire en functionele eigenschappen. In vitro astrocyten celculturen kunnen worden gebruikt om de biologische functies van deze gliacellen in detail te onderzoeken. Deze video protocol toont hoe zuivere astrocyten verkrijgen door het kweken van gemengde corticale cellen van muis pups. De methode is gebaseerd op de afwezigheid van levensvatbare neuronen en de scheiding van astrocyten, oligodendrocyten en microglia, de drie gliale celpopulaties van het centraal zenuwstelsel, in cultuur. Representatieve beelden tijdens de eerste dagen kweken de aanwezigheid van een gemengde celpopulatie en dan het tijdpunt bij astrocyten worden confluent en te scheiden van microglia en oligodendrocyten. Bovendien tonen we aan zuiverheid en astrocytaire morfologie van gekweekte astrocyten met behulp van immunocytochemische kleuringen voor goed ingeburgerd ennieuw beschreven astrocyten markers. Deze cultuur systeem kan gemakkelijk worden gebruikt om zuivere muis astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium te verkrijgen voor het bestuderen van verschillende aspecten van de astrocyten biologie.
Astrocyten een zeer overvloedig celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). De verhouding van astrocyten om neuronen is 1:3 in de cortex van muizen en ratten, terwijl er 1,4 astrocyten per neuron in de menselijke cortex 1. Interesse in astrocyten functie is dramatisch toegenomen in de afgelopen jaren. Een belangrijke functie van astrocyten is hun rol bij het verlenen van structurele en metabole steun aan neuronen 2,3. Nieuw ontdekte rollen voor astrocyten bestrijken een breed spectrum van functies. Deze omvatten het geleiden van de migratie van ontwikkeling axonen en bepaalde neuroblasten tijdens de ontwikkeling 4-6, functies in synaptische transmissie, synaps sterkte en informatieverwerking door neurale circuits 7-9, rollen in bloed-hersen barrière (BBB) vorming 10 en 11-13 integriteit en regulering van de cerebrovasculaire toon 14. Een ander belangrijk kenmerk van astrocyten is hun reactie op letsel. Onder pathologische omstandigheden astrocytes worden reactief en verder opreguleren de expressie van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure proteïne (GFAP) en remmende extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 15,16. Reactieve astrocyten bakenen de schade site van gezond weefsel door vorming van een gliale litteken, die voornamelijk bestaat uit astrocyten afgescheiden ECM-eiwitten van de chondroïtinesulfaat proteoglycan (CSPG) familie, de belangrijkste factoren die een remmende axonale regeneratie na CNS verwonding 15-17.
Astrocyten afkomstig uit radiale glia (RG) cellen tijdens de late embryogenese en de vroege postnatale leven. Na astrocyten specificatie opgetreden, astrocyten precursoren migreren hun eindposities, waar het proces van terminale differentiatie beginnen. In vivo, astrocyten lijken mature drie tot vier weken na de geboorte zoals aangegeven door hun typische morfologie 18,19. Een subpopulatie van cellen RG zetten in subventriculaire zone astrocyten (type B-cellen). Both, RG en type B cellen functioneren als astrocyten zoals neurale stamcellen (NSC's) tijdens ontwikkeling en in het volwassen respectievelijk. Net als astrocyten, RG en type B-cellen ook uitdrukking van de specifiek in de astrocyten glutamaat transporter (GLAST), hersenen lipide-bindend eiwit (BLBP) en GFAP, wat aangeeft dat deze markers niet kunnen uitsluitend worden gebruikt om specifiek te labelen volwassen astrocyten. In tegenstelling tot volwassen parenchymale astrocyten, die niet delen in de gezonde hersenen, RG en type B cellen vertonen stamcel potentieel, zoals het vermogen om zichzelf te vernieuwen. Ontregeling van astrocyten is betrokken bij talrijke ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer 20,21, de ziekte van Huntington 22, Parkinson 23, Rett-syndroom 24 en Alexander de ziekte 25. Bovendien astrocyten reageren op alle beledigingen van het CNS, wat leidt tot activatie en astrocyten astrocytische gliale littekenvorming 16,26. De astrocytaire gliale litteken dat volgende hersenen tr vormtAUMA of het ruggenmerg letsel wordt gedacht dat de belangrijkste belemmering voor neuronale regeneratie 15 zijn.
De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te handhaven gezuiverde populaties van cellen is essentieel voor het begrip van het zenuwstelsel. Pionierswerk door McCarthy en de Vellis stelt onderzoekers tot nu toe tot bijna zuivere culturen van astrocyten te bereiden van neonatale rat weefsel 27. Er is veel geleerd over astrocyten biologie met behulp van deze methode, die hier wordt gepresenteerd in een licht gewijzigde vorm voor het isoleren van de muis corticale astrocyten. Aanvulling in vivo studies, astrocyten en geconditioneerd medium verkregen met de beschreven in vitro cultuur waardevolle hulpmiddelen om verder inzicht te krijgen in astrocyten functies.
De hier beschreven werkwijze is gebaseerd op de astrocyt preparaat van neonatale hersenen van knaagdieren, oorspronkelijk beschreven door McCarthy en de Vellis in 1980 27. De aangepaste methode van de isolatie en de cultuur van corticale astrocyten van postnatale P1 tot P4 hersenen van muizen die hier is snel, levert zuivere primaire astrocyten en is zeer reproduceerbaar. Deze techniek kan eenvoudig worden overgedragen naar astrocyten isoleren van andere soorten, zoals van de rat en varken en andere hersengeb…
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door de Fazit Foundation Graduate Fellowship om SS, het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF 01 EO 0803) aan KB en de Europese Commissie KP7 Subsidieovereenkomst PIRG08-GA-2010 tot 276,989, NEUREX, en de Duitse Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 van CS De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
Astrocyte culture media | |||
DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
Solution for brain tissue digestion | |||
HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
Other | |||
70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |