כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

1. הכנת פרוסות רשתית להרכיב את התא (עיצוב באיור 1). מקום שני אגלי שומן ואקום, במרווחים ~ 8-10 מ"מ זו מזו, על פני חדר ההקלטה ליצירת ערוץ לsuperfusate ושבו כדי להטביע את פרוסות הרשתית. הוסף שני חרוז של שומן כמה מילימטרים רחוקים יותר מעבר לכל אחד משני אגלי שומן אלה לפעול כסכר וגלישת גבול. מניחים חתיכה קטנה של KimWipe משולשת בקצה של החדר, כדי להבטיח מגע עם נוזל אלקטרודה ההשוואתית. לחץ פיסת קרום nitrocellulose (~ 5 x 10 מ"מ; 0.8 נקבוביות מיקרומטר) שטוח על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית לשני חרוזים קטנים של שומן ואקום. יש להימנע מלמקם גריז ישירות מתחת למרכזו של קרום nitrocellulose, כמו זה יכול למנוע את הרשתית מהדבקות. כדי להכין את מבצע הרקמות, לשבור את סכין גילוח קצה כפול ל -4 חתיכות ולצרף אחד לזרועות חיתוך. לחתוך פרוסה דקה של nitrocellulקרום OSE כדי להבטיח שחוד החנית של סכין הגילוח מניח שטוח נגד תא ההקלטה ולכן חותך צורה נקיה דרך קרום nitrocellulose. שמור על כוס קטנה של תמיסת מלח דוחי (טבלת 1) על קרח בתחנה לנתיחה. להרדים סלמנדרה על ידי עריפת ראש. Hemisect ראש sagitally ושעם דרך חוט השדרה. מחצית במקומו של הראש על פיסת צמר גפן טבולה בתמיסת מלח דוחי על גבי בלוק הלינוליאום. החצי השני של הראש יכול להיות עטוף במגבת נייר לחה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר באותו היום. Enucleate העין. בעזרת מספריים Vannas קטנים, לחתוך את העור המחבר את העין למסלול הסובב. לאחר שחרור הקדמי של העין מהרקמה מסלולית שמסביב, מושך את העין קדימה והחלק את המספריים מתחת לעין כדי לחתוך את שרירי העין ואת עצב ראייה, לשחרר את העין ממסלולו. הנח את העין enucleated על מצע של צמר גפן עלבלוק. הלינוליאום מחק את מחצית הראש. Trim שומן מסלולית עודף מהחלק האחורי של העין. לעשות חתך קטן במרכזה של קרנית עם להב כירורגי חד. הסר את הקרנית על ידי הזזה מספריים Vannas עדינים לתוך החתך והארכת לחתוך רדיאלית החוצה לכיוון serrata האורה. חותכים circumferentially סביב serrata האורה על ידי ההחלפה של הבלוק לינולאום או הכותנה בין קיצוצים. לאחר חיתוך כל הדרך סביב העין, להסיר את הקרנית ואת העדשה על ידי משייכתם מהצד של עיינית. הזז את עיינית התוצאה על משטח קשה של גוש הלינוליאום טבולה בתמיסת מלח האמפיביים. לחתוך אותו לשלישים עם סכין גילוח חד בתנועות ניסור עדינות, כדי להבטיח שיש לך לחתוך את כל הדרך דרך לובן העין. מקום אחד או שתי חתיכות של עיינית על קרום nitrocellulose עם פני שטח הרשתית פונות כלפי מטה. להטביע את החתיכות שנותרו עם מי מלח נוסף ומניח אותם במקרר ב~ 4 ° C. גהntly לחץ על פיסת עיינית נגד קרום nitrocellulose עם מלקחיים עדינים. להטביע את קרום nitrocellulose וחתיכת עיינית עם כמה טיפות של מי מלח קר ודוחים כתם בקצוות עם KimWipe לעזור הרשתית לדבוק. שוב, להטביע את עיינית וקרום nitrocellulose עם כמה טיפות של תמיסה מי מלח קר דוחי ולקלף את האפיתל לובן העין / דמית העין / רשתית פיגמנט לבודד את הרשתית (שיכול להופיע ורוד בשל נוכחותם של rhodopsin מולבן). במידת צורך, לחתוך את עצב הראייה לשחרר את הרשתית. אם הרשתית אינה דבקה בחוזקה, להתנקז המלוחים עם Kimwipe למשוך את הרשתית למטה יותר בחוזקה על קרום nitrocellulose. החלף את תמיסת מלח. חזור, במידת צורך. למלא את התא עם מי מלח דוחי קר ולהעביר אותו לשלב של מבצעה הרקמה. פורסים את הרשתית וקרום nitrocellulose לרצועות דקות, עבודה מקצה אחד לקצה השני על ידי סיבוב מיקרומטר רניהבמרווחים של 125 מיקרומטר. לחץ על סכין הגילוח בעדינות אך בתקיפות דרך הרשתית וקרום nitrocellulose. העבר את פרוסות רשתית על ידי הזזת רצועות של קרום nitrocellulose לערוץ הראשי של חדר ההקלטה. הרם רצועה של קרום חופשי ולאחר מכן להחזיק אותו במקום בעת הזזת החדר מתחתיו, להיות בטוח כדי לשמור את הפרוסות מתחת למים. הטמע את הקצוות של קרום nitrocellulose ברצועות שומן ואקום, מסתובב להם 90 מעלות כדי להציג את שכבות הרשתית. לחץ שטוחות קרום nitrocellulose כנגד משטח הזכוכית. גם אם יש לא רשתית על כל פיסה, רצועות מקום של קרום nitrocellulose במרווחי זמן קבוע (~ 1 מ"מ זה מזה) לאורך כל אורכו של ערוץ זלוף כדי לעזור לשבור את מתח הפנים ולשפר את זרימת נוזל. 2. כל תא הקלטות לזווג אחרי כל את הפרוסות הועברו, להזיז את תא ההקלטה לשלב של זקוף, קבועהמיקרוסקופ הבמה ולצרף את ההובלה אלקטרודה ההשוואתית. להתמקד בפרוסות באמצעות מרחקים ארוכים עובדים, טבילה במים, 40-60x אובייקטיבי. מיקרוסקופ צריך להיות ממוקם על שולחן אוויר כדי לצנן את התנודות ומוקפות בכלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות חשמליות. Superfuse את הפרוסות ברציפות בשיעור של מ"ל / דקה 1 עם תמיסת מלח דוחי מבעבעים עם 100% O 2. חבר את היניקה, ולוודא כי יבוא והיצוא הם מאוזנים. יצוא יכול להיות מוסדר על ידי סיבוב הקצה המשופע של מחט השאיבה או על ידי העברת KimWipe בסוף התא קרובה יותר או רחוקה יותר ממחט יצוא. יכולה להיות כל הזמן ההכנה בטמפרטורת חדר או מקורר עם מכשיר פלטייה או פשוט על ידי קביעת שקית קרח על הבמה מיקרוסקופ. בחן את הפרוסות תחת אור עמום או אינפרא אדום ולזהות זוג תאים – photoreceptor (מוט או קונוס) ותא אופקי או דו קוטבי קרוב – ליעד להקלטה כל התא. מוטות יכולות להיות אניdentified ידי גופי התא הגדולים שלהם וכמו מוט מגזרים חיצוניים בולטים (איור 2 א). קונוסים קטנים יותר ממוטות ויש מגזרים חיצוניים מחודדים קטנים. תא דו קוטבי וsomas תא האופקי הם בשורה החיצונית ביותר של גופי תא בשכבת הגרעין הפנימי (INL; דמויות 2B ו 2 ג). לפני הכנת פרוסות, השתמש בחולץ פיפטה לייצר micropipettes מזכוכית ורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.2 מ"מ, קוטר 0.95 מ"מ פנימי עם חוט זכוכית). הקצה של כל micropipette צריך להיות ~ 1-2 מיקרון בקוטר. באמצעות מחט מילוי לא מתכתית (לדוגמה אחד מיוצרת ממזרק 1 סמ"ק או MicroFil), למלא pipettes עם הפתרון תאי (טבלת 1) ולצרף למחזיק האלקטרודה. לרומם את מטרת מיקרוסקופ במקצת. מקם את פיפטה photoreceptor מתחת למטרה ולאחר מכן להוריד אותו כך שהקצה ממוקם בדיוק מעל את הפרוסות. חזור עם tהוא טפטפת שני. התאם כל קיזוז ברמה הנוכחית הבסיסית על המגבר. בדקו את התנגדות פיפטה עם דופק depolarizing mV 5-10. בדרך כלל אנו משתמשים בטפטפות שהטווח 10-15 MΩ, התוצאה של להתחדד הארוך של הפיר וosmolarity הנמוך של פתרונות פיפטה דו החיים. עם פתרונות יונקים osmolarity גבוהים יותר, אותם pipettes מפגין ערכי התנגדות של ~ 8-12 MΩ. אמנם יש לנו בשימוש בקטרים ​​טיפ גדולים יותר עם ערכי התנגדות של 3-4 MΩ בפתרונות דו חיים, את היתרונות הניתנים על ידי התנגדות גישה נמוכה מתקזזים עם קשיים רבים באיטום על גבי קרום תא ומוזנח מהיר יותר של זרמי סידן ושליח שני אחר תגובות רגישות. תוך יישום קל חיובית לחץ, עמדת פיפטה פוסט סינפטי כך שהוא קשר גוף התא האופקי או דו קוטבי. לאחר מכן מקם את פיפטה presynaptic כך שהוא קשר גוף התא של photoreceptor מוט או קונוס. הקלטות appeAR להיות יציב יותר, כאשר טיפים פיפטה לפנות המגזר הפנימי ולא הסומא, במיוחד בקונוסים. תוך מעקב ההתנגדות לשחרר את הלחץ החיובי על פיפטה פוסט סינפטי. לפעמים, על שחרורו של לחץ חיובי מספיק כדי ליצור חותם gigaohm. אם לא, תחול שאיבה עדינה עם מזרק 1 מ"ל או דרך פה. לאחר התנגדות הטיפ גדלה> 100 MΩ, להחיל פוטנציאל החזקת -60 mV. לאחר קבלת חותם gigaohm, null את כל עוברי קיבול פיפטה ולחזור על תהליך האיטום לפיפטה photoreceptor, החלת פוטנציאל החזקת mV -70. קרע התיקון על ידי שימוש בפה שלך או מזרק ליישם יניקה לכל תא בתורו. מוטות, חרוטים, ותאים דו קוטבי יהיו בדרך כלל קרע עם שאיבה עדינה. קבלת תצורה כל תא עם תא אופקי עשויה לדרוש יניקה גדולה יותר (כלומר עם מזרק סמ"ק 3) בשילוב עם פולסים מהירים מתח חזקים נמסרו עם F "זאפ"eature של מגבר תיקון המהדק. הקרע של הקרום והקמתה של תצורה כל התא יהיה ברור על ידי הופעתו של ארעיים קיבול כל התא. לאשר את הזהות של תא פוסט סינפטי פיזיולוגית על ידי יישום הבזק אור ומספק שורה של צעדי מתח מ-120 ל40 mV במרווחים של 20 mV (איורים 3 ו -4). כדי להעריך אם זוג התאים מחובר synaptically, לספק, שלילת קוטביות קצרה (25-100 אלפיות השני) 60 mV צעד לphotoreceptor (ל -10 mV, בסמוך לשיא של L-סוג סידן מתח מגודרת הנוכחי) ולחפש לזרמי פוסט סינפטיים בנוירון הצו השני (איור 5). צעד depolarizing חזק צריך לעורר נוכחי מהר, חולף פנימה פוסט סינפטי בתא דו קוטבי האופקי או OFF פוסט סינפטי הנגרם על ידי פרץ של שחרור משלפוחית ​​החרוט (איור 5).