両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

1。網膜スライスの準備チャンバー（ 図1に示される設計）を組み立てる。場所真空グリースの2つのビード、superfusateためのチャネルを形成し、網膜切片を埋め込むする記録チャンバを横切る離間〜8〜10ミリメートル。堤防とリミット波及として機能するように数ミリ遠くからグリース、これらの2つのビーズの各越えグリースの第2のビードを追加します。基準電極と流体接触を確保するために、チャンバの端部にキムワイプの小さい三角形の部分を配置する。 真空グリースの二つの小さなビーズにガラス顕微鏡スライドに対してフラット、ニトロセルロース膜（0.8μmの孔〜5×10㎜）の部分を押してください。これが付着するの網膜を防ぐことができますように、直接ニトロセルロース膜の中央下にグリースを入れないようにしてください。 組織スライサーを準備するには、4の部分にダブルエッジかみそりの刃を分解し、スライシング腕にものを添付してください。 nitrocellulの薄いスライスをカット大証は膜カミソリ刃の刃先が、記録室に対して平らに産むので、ニトロセルロース膜を通ってきれいにカットしていることを確認する。 解剖駅で氷の上で両生類食塩水（ 表1）の小さなビーカーを保管してください。 断頭によりサンショウウオを安楽死させる。脊髄を通してsagitally頭と髄を二等分する。綿の部分での頭の代わりに半分はリノリウムブロックの上両生類生理食塩水で湿らせた。頭のもう半分は湿ったペーパータオルで包み、4℃で保存できます一日で後で使用するためのC。 目を摘出。小さなVannasはさみを使用して、周囲の軌道に目を接続する皮膚を切った。周囲の軌道組織から目の前を解放した後、前方に目を引いて、軌道から目を解放し、目の筋肉と視神経を切断するために目の下ハサミをスライドさせます。 上の綿のベッドの上で摘出目を置きリノリウムブロック。半分頭を破棄。目の奥から余分な眼窩脂肪をトリミング。 鋭い外科刃で角膜の中央に小さな切開を行います。切開に細かいVannasはさみをスライドし、鋸状縁に向かって放射状にカットを拡張することにより、角膜を削除します。リノリウムブロックやカットの間に綿を回転させることにより、鋸状縁の周りに円周方向にカットします。 目の周りのすべての道をカットした後、アイカップの側面からそれらを引いて、角膜とレンズを取り外します。両生類の食塩水で湿らせたリノリウムブロックの硬い表面に生じたアイカップを移動します。あなたは強膜を介してすべての道をカットしていることを確実にするために細かい鋸モーションを使用して、鋭利なカミソリの刃を持つ分にそれをカットします。 下向き網膜表面とニトロセルロース膜上のアイカップの1つまたは2つのピースを置きます。水没追加の食塩水で、残りの部分をして〜4℃の冷蔵庫の中に置いてください Geのntly細かいピンセットでニトロセルロース膜に対して、アイカップの部分を押してください。網膜が付着するのに役立つようにキムワイプとエッジで冷たい両生類生理食塩水とブロットを数滴と水没ニトロセルロース膜とアイピース。冷たい両生類生理食塩液と剥がれ強/脈絡膜/（無漂白ロドプシンの存在に起因するピンク色現れることができます）網膜を分離する網膜色素上皮を数滴ともう一度、水没アイカップ、ニトロセルロース膜。必要に応じて、網膜を解放するために視神経を切った。 網膜がしっかり付着していない場合は、ニトロセルロース膜にもっとしっかりと網膜をプルダウンするキムワイプで生理食塩水を離れて排出します。生理食塩水を交換してください。必要に応じて繰り返します。 冷たい両生類生理食塩水室を記入し、組織スライサーの段階に転送します。バーニアマイクロメータを回して、もう一方の端から作業し、薄い短冊状に網膜とニトロセルロース膜をスライス125μm刻み。網膜とニトロセルロース膜を通して慎重に、しっかりとカミソリの刃を押してください。 記録室のメインチャンネルにニトロセルロース膜のストリップを移動することによって網膜スライスを転送します。遊離膜のストリップを持ち上げ、その下に室を動かしながらスライスが水没維持することを確認され、所定の位置に保持。網膜の層を表示するためにそれらを90度回転させ、真空グリースのストリップでニトロセルロース膜の端を埋め込む。 ガラス面に対して平らニトロセルロース膜を押してください。すべての作品で網膜がない場合でも、灌流チャネルの全長に沿って一定の間隔（離れ〜1㎜）でニトロセルロース膜の代わりにストリップは表面張力を壊すと流体の流れを改善するのに役立ちます。 2。ペアの全細胞録音すべてのスライスが転送された後、固定された、直立のステージに記録チャンバを移動させるステージ顕微鏡および基準電極リードを接続します。長いワーキングディスタンス、水浸漬、40-60X対物レンズを用いてスライスに焦点を当てています。顕微鏡は、振動を減衰するためのエアテーブル上に配置され、電気的干渉を低減するためファラデーケージで囲むべきである。 100％のO 2でバブリング両生類食塩水で1ml /分の速度で連続的にスライスを表面かん流する。流入と流出のバランスがあることを確認しながら、吸引を接続します。流出は、吸引針の面取り端部を回転させることにより、または近づけたり遠く流出針からチャンバの端部にキムワイプを動かすことによって調整することができる。製剤は、室温に保たまたはペルチェ素子、または単に顕微鏡のステージ上にアイスパックを設定することにより冷却することができる。 薄暗いまたは赤外光の下でスライスを調べ、細胞のペアを識別 – 全細胞記録の対象に – 光受容体（ロッドまたはコーン）、近くの水平または双極細胞を。ロッドはIすることができますそれらの大きな細胞体と著名な棒状の外節（ 図2A）によりdentified。コー​​ンは棒よりも小さいと小さなテーパー外側セグメントを持っている。双極細胞と水平細胞の細胞体は、内顆粒層における細胞体（; 図2Bおよび2C INL）の最も外側の行にある。 スライスを準備する前に、ホウケイ酸ガラス（1.2ミリメートル外径、ガラス繊維と0.95ミリメートル、内径）から、マイクロピペットを製造するピペットプラーを使用しています。各マイクロピペットの先端は直径〜1-2ミクロンであるべきである。 非金属充填針（ 例えば、1 ccのシリンジまたはMicroFilから製造1）を用いて、細胞内液（ 表1）とピペットを記入し、電極ホルダに取り付ける。 若干顕微鏡対物を高める。目的の下に感光ピペットを置き、次に先端がただのスライスの上に位置するようにそれを下げる。 Tで繰り返し彼二ピペット。 アンプのベースライン、現在のレベルで任意のオフセットを調整します。 5-10 mVの脱分極パルスでピペットの抵抗をチェックします。我々は一般的に10〜15MΩの範囲、シャフトの長いテーパーと両生類ピペットソリューションの低浸透圧の結果というピペットを使用しています。高い浸透圧哺乳類のソリューションにより、これらの同じピペットはMΩ〜8-12の抵抗値を示す。我々は両生類溶液中の3-4MΩの抵抗値を有するより大きなチップ直径を使用しているが、より低いアクセス抵抗によって提供される利点は、細胞膜およびカルシウム電流および他のセカンドメッセンジャーのより迅速な要約上に封止における大きな困難によって相殺される敏感な反応。 若干の正圧、位置をシナプス後ピペットをかけながら、それが接触する水平または双極細胞体をそのように。それは接触ロッドや錐体の細胞体をするようにシナプス前ピペットを配置。録音付ピペットチップではなくソーマより内側のセグメントに連絡する際、Arは特にコーンで、より安定しています。 抵抗を監視しながら、シナプス後ピペットで正圧を解放。時には、正圧の放出はギガオームシールを形成するのに十分である。そうでない場合は、1ミリリットルのシリンジでまたは口から優しい吸引を適用します。先端抵抗がMΩ> 100に成長した後、-60 mVでの保持電位を適用します。ギガオームシールを取得した後、任意のピペット容量過渡をnullにし、-70 mVでの保持電位を適用する、体ピペット用シーリング手順を繰り返します。 破裂あなたの口や順番に各セルに吸引を適用するための注射器を使用してパッチ。ロッド、コーン、および双極細胞は穏やかな吸引破裂通常ます。水平細胞と細胞全体のコンフィギュレーションを取得する"ザップ" Fに付属の強力なクイック電圧パルスとの組み合わせでより大きな吸引力を（3 ccのシリンジとIE）が必要な場合がありパッチクランプアンプの特集。全細胞構成の膜と設立の破裂は全細胞キャパシタンスの過渡電圧の出現によって明らかになるであろう。 光フラッシュを適用し、20 mVの増分（ 図3、図4）-120〜+40 mVの電圧からの一連の手順を提供することで、生理的にシナプス後細胞の身元を確認してください。 細胞のペアがシナプス接続している場合、体に短い（25から100ミリ秒）、60 mVのステップの脱分極を実現（-10 mVにまで、L型電位依存性カルシウム電流のピーク付近）と見て評価するために、二次ニューロンにシナプス後電流（ 図5）。強い脱分極ステップはコーン（ 図5）から、小胞の放出のバーストによって引き起こされるシナプス後水平またはOFF双極細胞に速く、過渡内側シナプス後電流を呼び起こす必要があります。