في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية
Summary
نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر (<em> Ambystoma tigrinum</em>) وشرح كيفية استخدام هذه الشرائح لدراسة تجهيز متشابك في شبكية العين عن طريق الحصول مزدوج كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الدرجة الثانية.
Abstract
واحدة من المهام المركزية في علم الأعصاب الشبكية هو فهم الدوائر من الخلايا العصبية للشبكية، وكيف تلك الاتصالات هي المسؤولة عن تشكيل الاشارات المرسلة الى المخ. تم الكشف عن الفوتونات في شبكية العين بواسطة قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء، التي تحول تلك الطاقة إلى إشارة كهربائية، نقلها إلى الخلايا العصبية للشبكية أخرى، حيث تتم معالجتها وإرسالها إلى الأهداف المركزية في المخ عبر العصب البصري. جاء في وقت مبكر رؤى هامة في الدوائر الشبكية وتجهيز مرئي من الدراسات النسيجية من 1،2 كاجال و، في وقت لاحق، من التسجيلات الكهربية من النشاط ارتفاعه من خلايا الشبكية العقدة – خلايا شبكية العين الناتج من 3،4.
فهم مفصل من المعالجة البصرية في شبكية العين يتطلب فهم الإشارات في كل خطوة في مسار من مبصرة إلى الخلايا العقدية للشبكية. ومع ذلك، العديد من أنواع الخلايا في شبكية العين هي برالعبوات الناسفة عميق في الأنسجة وبالتالي لا يمكن الوصول إليها نسبيا لتسجيل الكهربية. هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال العمل مع شرائح عمودية، في الخلايا التي المقيمين داخل كل طبقة من طبقات شبكية العين هي واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها لتسجيل الكهربية.
هنا، نحن تصف طريقة لصنع المقاطع الرأسية من شبكية العين من اليرقات نمر السلمندر (Ambystoma tigrinum). في حين تم تطوير هذا المستحضر في الأصل للتسجيلات مع microelectrodes حادة 5،6، ونحن تصف طريقة لثنائي كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الدرجة الثانية التي نعمل التلاعب المحتملة غشاء مبصرة في حين تم تسجيل في وقت واحد بعد ردود متشابك في الخلايا الأفقية أو ثنائي القطب. مبصرات من نمور التاميل السمندل هي أكبر بكثير من تلك الأنواع من الثدييات، مما يجعل هذا الإعداد المثالي ليتخذوا فيه تينهجه التجريبية تحديا تقنيا. ويرد وصف هذه التجارب مع العين في اتجاه يحقق في خصائص اشارة من الشريط متشابك – هيكل متشابك المتخصصة وجدت في عدد قليل فقط من الخلايا العصبية، بما في ذلك قضيب ومخروط مبصرات، التي هي مناسبة تماما للحفاظ على نسبة عالية من منشط الافراج عن العصبي 7 ، 8 – وكيف أنه يساهم في خصائص اشارة فريدة من نوعها من هذا أولا المشبك الشبكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت إعداد شريحة الشبكية مفيدة جدا لتحليل الدوائر والآليات التي تستخدمها في شبكية العين لمعالجة المعلومات البصرية. كانت القدرة على الحصول على تسجيلات خلية كاملة في وقت واحد من الخلايا العصبية قبل وبعد متشابك مفيدة بشكل خاص في هذا المسعى. إقران تسجيلات خلية كاملة هي أسهل بكثير لتحقيق مع شرائح من شبكية العين مع الاستعدادات مسطحة جبل لأن يتعرض لها طبقات الشبكية المختلفة. وعلاوة على ذلك، لأن من الخلايا العصبية في شبكية العين الخاصة بهم كبيرة، السلمندر لها تاريخ طويل تمهيدا الشبكية، وبالتالي توفير نظام نموذجي خاصة تتميز جيدا.
مع الممارسة، وشرائح صحية من السمندل شبكية العين يمكن أن تكون مستعدة بشكل منتظم. ويمكن لبعض الخطوات الرئيسية يجعل الفرق بين النجاح والفشل. 1) تأكد من هي التي شنت على شفرة الحلاقة على تقطيع اللحم والأنسجة بحيث يضع شقة ضد سطح الزجاج وشرائح نظيفة على الرغم من كل الأنسجة وunderlyiنانوغرام غشاء النيتروسليلوز. إذا كنت قد قدمت خفض نظيفة من خلال غشاء النيتروسليلوز، يجب أن تسمع بنقرة وخافت مثل شفرة حلاقة الضربات سطح شريحة زجاجية. 2) تأكد من التزمت الشبكية إلى غشاء النيتروسليلوز. خلاف ذلك، يمكن أن شبكية العين تطفو بعيدا عن غشاء خلال أي مرحلة من مراحل الإجراءات. 3) لا تعرض قطع شرائح في الهواء، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف العديد من الخلايا السطحية. 4) تأكد من أن شرائح وغشاء النيتروسليلوز شقة تقع ضد شريحة زجاجية بحيث طبقات الشبكية واضحة تحت المجهر تشريح. 5) تحقيق التوازن بين معدلات تدفق superfusate وتدفق من أجل تجنب تفيض غرفة تسجيل. هذا يمنع التغيرات المفاجئة في مستويات الحل، الذي يمكن أن يسبب حركات الأنسجة المفاجئ. 6) اختيار زوج صحية من الخلايا قريبة من بعضها البعض. الخلايا التي تحتوي السيتوبلازم على نحو سلس وأكثر صحة من الخلايا مع السيتوبلازم محبب. الخلايا أعمق في شريحة هم أكثر عرضة للاحتفاظ يخدع متشابك سليمةالكياسة. 7) تأكد من غيض ماصة لم يكسر أو نحى ضد الأنسجة الأخرى أو الحطام على طول الطريق وصولا إلى الخلايا. 8) للتحقق من مقاومة ماصة لضمان عدم انسداد مع الحطام أو فقاعة، وكلاهما يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على تسجيل كامل الخلية الجودة.
بدلا من ربط شبكية العين على الورق مرشح النيتروسليلوز، تضمين بعض المحققين شبكية العين في كتلة من أجار واستخدام vibratome لخفض شرائح الشبكية. على الرغم من أننا لم يحاكم هذا النهج، كيم وآخرون. 11 مناقشة مزايا كلا النهجين. في تجربتهم، النهج القائم على أجار يوفر العائد أكثر اتساقا من شرائح مسطحة مع طبقات الشبكية-يرسم بشكل جيد ولكن النهج القائم على الورق مرشح ينتج خلايا مستقبلة للضوء أكثر صحة.
قضبان ومخاريط هي المسؤولة عن transducing الضوء إلى تغيرات في غشاء المحتملة. مع تسجيلات المقترنة، لا يمكن للغشاء المحتملة من قضبان أو الأقماع يكون manipulانبعاث العوادم مباشرة وبالتالي فإن القدرة على توليد استجابات ضوء، في حين مفيدة لتحديد أنواع الخلايا، قد لا تكون ضرورية. ولذلك فإننا كثيرا ما تعد شرائح في الضوء الأبيض. ومع ذلك، حتى عندما أعدت تحت إضاءة ساطعة، يمكن السمندل الخلايا العصبية للشبكية توليد استجابات ضوء كبيرة كما يتضح من الردود في الشكل. 3. ويرجع ذلك جزئيا إلى خزان كبير نسبيا من حامل اللون في حجم كبير الجزء الخارجي ولكنها قد تعكس أيضا قدرة الخلايا على تجديد مولر 11-CIS-الشبكية لالأقماع 12. للحصول على كامل الردود ضوء الظلام مكيفة، يمكن للمرء أن إعداد الشرائح تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء. لتشريح تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء، ونحن نعلق GENIII صورة مكثفات (Nitemate NAV3، ليتون إندستريز، تمب، من الألف إلى الياء) لمن خلال oculars المجهر تشريح وإلقاء الضوء على الأنسجة مع مصباح يدوي LED الأشعة تحت الحمراء. لتقطيع وغيرها من الإجراءات التي لا تجري تحت مجهر تشريح، ونحن توظيف IMA رئيس محمولةGE تكثيف. لوضع ماصات التصحيح، ونحن تصور شرائح باستخدام كاميرا CCD حساس الأشعة تحت الحمراء (على سبيل المثال WATEC 502H، WATEC شركة، ميدلتاون، NY) لنصرة تستقيم، المجهر مرحلة ثابتة. مع هذه الاحتياطات، يمكن للمرء الحصول على ردود قضيب واظهار حساسية فوتون واحد 6 و 13.
واحد الحد من العمل في شرائح الشبكية هو أن العمليات الخلوية طويلة من الخلايا العصبية حقل كبير الشبكية قد تفقد العديد من التشعبات من خلال إجراء تشريح. ولذلك الاستعدادات شريحة الشبكية هي أكثر فائدة لدراسة علم وظائف الأعضاء من الخلايا فيه اتصالات متشابك تنطوي على عمليات بالقرب من خلايا الجسم. شبكية العين البرمائيات والثدييات تشترك في العديد من أنواع الخلايا نفسها، والاستفادة من آليات فسيولوجية مماثلة 14-16. بينما السمندل شبكية العين هو نموذج جيد لكثير من جوانب شبكية الثدييات، فارق واحد مهم ويبدو أن وجود مسار مخصص قضيب في الثدييات التي INVOالتلاميذ اتصالات من الخلايا المتخصصة قضيب القطبين على AII خلايا عديم الاستطالات 14. على قيد إضافي من شبكية العين السمندل هو عدد قليل من الأدوات الوراثية وضعت خصيصا لهذه الأنواع. ومع ذلك، والأجسام المضادة والكواشف shRNA التي تستهدف المناطق المحمية جيدا في الأنواع الأخرى يمكن أن تستخدم بنجاح في السمندل، كما يمكن العديد من مثبطات جزيء صغير والكواشف الببتيد. بالإضافة إلى ذلك، مع بضعة تعديلات في تقنية، يمكن إعداد شرائح الشبكية من الأنواع الأخرى التي بعض من هذه الأدوات هي أكثر توافرا.
وراء فائدتها لإقران تسجيل كامل الخلية، وإعداد شريحة الشبكية السمندل هو أيضا قابلة لمجموعة متنوعة من المناهج الأخرى. كما نوقش أعلاه، شرائح الشبكية يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات ضوء في تركيبة مع مختلف البروتوكولات المشبك الجهد 17. ويمكن أيضا أن يتم تحميل الخلايا العصبية للشبكية مع الأصباغ الفلورية حساسة للكا 2 +، الكلورين -، أو نا+ قدم من خلال ماصة التصحيح أو بواسطة حمام تطبيق 15،18-20. ويمكن إدخال A الببتيد الفلورسنت التي تربط إلى الوشاح متشابك 21 من خلال ماصة التصحيح وتستخدم للتصوير الشريط أو 10، عندما مترافق إلى فلوريسئين، لحاد وإلحاق أضرار انتقائي الشريط 22. وقد استخدمنا أيضا شرائح الشبكية في تركيبة مع نقاط الكم لرصد تحركات قنوات الكالسيوم الفردية في قضيب ومخروط المحطات متشابك 23. وهكذا، فإن شريحة الشبكية العمودي هو إعداد التجريبية تنوعا لدراسة آليات متشابك الأساسية وظائف معالجة فريدة من نوعها أجريت في المشبك الأولى في مسار الإشارات البصرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق البحث للوقاية من العمى والمعاهد الوطنية للصحة منح EY10542.
Materials
| Name of the reagent/material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue slicer | Stoelting | 51425 | |
| Double edge razor blades | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | AAWP02500 | Type AAWP 0.8 mm pore |
| Borosilicate glass pipettes | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1.2mm OD 0.95 mm ID |
| Ag/AgCl pellet | Warner | E206 | |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Filling needle, 67 mm long |
References
- Ramòn y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. . The Structure of the Retina. , (1972).
- Piccolino, M. Cajal and the retina: a 100-year retrospective. Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).
- Hartline, H. K. The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina. Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).
- Kuffler, S. W. Discharge patterns and functional organization of mammalian retina. J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the riger salamander retina. J. Physiol. 280, 449-470 (1978).
- Wu, S. M. Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina. J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).
- Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).
- Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).
- Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells. Bioessays. 32, 609-614 (2010).
- Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse. J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).
- Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices. J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).
- Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation. Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).
- Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina. Neuroscience. 122, 785-798 (2003).
- Wu, S. M. Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).
- Babai, N., Thoreson, W. B. Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina. J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).
- Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors. Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).
- Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage. Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).
- Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors. J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).
- Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization. Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).
- Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation. Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming. Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).
- Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).
