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Neuroscience

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

Published: June 01, 2013
doi:
10.3791/50007
,
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences,University of Nebraska Medical Center , 2Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience,University of Nebraska Medical Center

Summary

Nous décrivons la préparation de tranches minces de la rétine aquatique salamandres tigrées (<em> Ambystoma tigrinum</em>) Et expliquer comment nous utilisons ces tranches d'étudier le traitement synaptique dans la rétine par l'obtention d'enregistrements de serrage de tension de cellules entières double de photorécepteurs et des cellules horizontales et bipolaire du second ordre.

Abstract

L'une des tâches centrales de la rétine neurosciences est de comprendre les circuits de neurones de la rétine et la façon dont ces liens sont responsables de la mise en forme des signaux transmis au cerveau. Les photons sont détectés dans la rétine par des bâtonnets et des cônes photorécepteurs, qui convertissent cette énergie en un signal électrique, le transmettre aux autres neurones de la rétine, où il est traité et transmis à des cibles dans le centre de cerveau par le nerf optique. Importants premiers aperçus dans les circuits de la rétine et le traitement visuel provenaient des études histologiques de 1,2 Cajal et, plus tard, à partir d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité de dopage des cellules ganglionnaires de la rétine – les cellules de sortie de la rétine 3,4.

Une compréhension détaillée du traitement visuel dans la rétine nécessite une compréhension de la signalisation à chaque étape de la voie de photorécepteur de cellules ganglionnaires de la rétine. Cependant, de nombreux types de cellules rétiniennes sont burIED en profondeur dans le tissu et donc relativement inaccessible pour l'enregistrement électrophysiologique. Cette limitation peut être surmontée en travaillant avec des tranches verticales, dans lequel les cellules résidant dans chacune des couches de la rétine sont clairement visibles et accessibles pour l'enregistrement électrophysiologique.

Ici, nous décrivons un procédé de fabrication sections verticales des rétines de larves de salamandres tigrées (Ambystoma tigrinum). Bien que cette préparation a été développé à l'origine pour des enregistrements avec des microélectrodes pointus 5,6, nous décrivons une méthode pour les enregistrements de serrage de tension de cellules entières double de photorécepteurs et des cellules horizontales et bipolaires second ordre dans lequel nous manipulons le potentiel de membrane du photorécepteur tout en enregistrant simultanément post- réponses synaptiques dans les cellules horizontales ou bipolaire. Les photorécepteurs de la salamandre tigrée sont beaucoup plus grandes que celles des espèces de mammifères, ce qui en fait une préparation idéale pour entreprendre tson approche expérimentale techniquement difficile. Ces expériences sont décrites avec un oeil vers sonder les propriétés de signalisation du ruban synaptique – une structure synaptique spécialisée trouvé dans une seule une poignée de neurones, y compris les bâtonnets et des cônes photorécepteurs, qui est bien adapté pour le maintien d'un taux élevé de tonique libération de neurotransmetteurs 7 , 8 – et comment il contribue aux propriétés uniques de signalisation de cette première synapse rétine.

Protocol

1. Tranches rétinienne Préparation Assemblez la chambre (conception illustrée dans la Figure 1). Placer deux billes de graisse à vide, espacée ~ 8-10 mm d'intervalle, à travers la chambre d'enregistrement pour former un canal pour superfusat et dans lequel les tranches de pouvoir incorporer la rétine. Ajouter un second cordon de graisse de quelques millimètres plus loin au-delà de chacun de ces deux bourrelets de graisse pour agir comme un lever et limite débordement. Placer un petit morceau triangulaire de Kimwipe à l'extrémité de la chambre pour assurer un contact de fluide avec l'électrode de référence. Appuyer sur un morceau de membrane de nitrocellulose (~ 5 x 10 mm, 0,8 pores um) à plat sur la lame de microscope en verre en deux petites billes de graisse à vide. Évitez de mettre la graisse directement sous le centre de la membrane de nitrocellulose, car cela peut empêcher la rétine d'adhérer. Pour préparer la trancheuse de tissu, rompre une lame de rasoir double tranchant en 4 morceaux et joindre une au bras de tranchage. Couper une fine tranche de nitrocellulMembrane ose faire en sorte que le bord coupant de la lame de rasoir à plat contre la chambre d'enregistrement et donc découpe proprement à travers la membrane de nitrocellulose. Gardez un petit bécher de solution saline amphibiens (tableau 1) sur la glace à la station de dissection. Euthanasier salamandre par décapitation. Hemisect la tête sagittal et la moelle par la moelle épinière. Placer la moitié de la tête sur un morceau de coton imbibé de sérum physiologique amphibien au sommet d'un bloc de linoléum. L'autre moitié de la tête peut être enveloppé d'une serviette en papier humide et conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure dans la journée. Énucléer l'œil. L'utilisation de petits Vannas ciseaux, couper la peau reliant l'oeil à l'orbite environnante. Après avoir libéré l'avant de l'oeil du tissu orbital autour, tirer l'œil vers l'avant et faites glisser les ciseaux sous l'œil de couper à travers les muscles de l'œil et le nerf optique, ce qui libère l'œil de l'orbite. Placez l'œil énucléé sur un lit de coton sur lede bloc de linoléum. Jeter la demi-tête. Coupez l'excédent de graisse orbitale à l'arrière de l'oeil. Faire une petite incision dans le centre de la cornée avec une lame chirurgicale pointu. Retirez la cornée en glissant Vannas ciseaux fins dans l'incision et l'extension de la coupe radialement vers l'ora serrata. Couper la circonférence autour de l'ora serrata en tournant le bloc de linoléum ou le coton entre les coupes. Après avoir coupé tout autour de l'œil, retirez la cornée et le cristallin en tirant sur le côté de l'œilleton. Déplacer l'œilleton résultant sur une surface dure du bloc de linoléum humidifié avec une solution saline amphibiens. Coupez-les en tiers avec une lame de rasoir, en utilisant un mouvement de scie bien à ce que vous avez coupé tout le chemin à travers la sclérotique. Placez un ou deux morceaux de œilleton sur la membrane de nitrocellulose avec la surface de la rétine vers le bas. Plonger les morceaux restants avec une solution saline supplémentaire et placez-les au réfrigérateur à 4 ° C ~ Geappuyez sur ntly le morceau de œilleton contre la membrane de nitrocellulose avec une pince fine. Plonger la membrane de nitrocellulose et un morceau de l'œilleton avec quelques gouttes de solution saline froide et épongez amphibien sur les bords avec Kimwipe pour aider la rétine d'adhérer. Une fois encore, plonger l'œilleton et la membrane de nitrocellulose avec quelques gouttes de solution saline amphibien froid et décoller la sclérotique / choroïde / épithélium pigmentaire rétinien pour isoler la rétine (qui peut apparaître rose en raison de la présence d'écru rhodopsine). Si nécessaire, couper le nerf optique pour libérer la rétine. Si la rétine n'a pas adhéré hermétiquement, drainer la solution saline avec un Kimwipe pour tirer la rétine plus fermement vers le bas sur la membrane de nitrocellulose. Remplacer la solution saline. Répétez si nécessaire. Remplir la chambre avec amphibien froide salée et le transférer dans le stade de la trancheuse de tissus. Tranche de la rétine et de la membrane de nitrocellulose en fines lamelles, de marche d'une extrémité à l'autre en faisant tourner le micromètre vernierdans 125 incréments um. Appuyez sur la lame de rasoir doucement mais fermement à travers la rétine et la membrane de nitrocellulose. Transférer les tranches de la rétine par le déplacement des bandes de membrane de nitrocellulose sur la voie principale de la chambre d'enregistrement. Soulever une bande de membrane libre et ensuite le maintenir en place tout en déplaçant la chambre en dessous, en vous assurant de garder les tranches submergés. Incorporer les bords de la membrane de nitrocellulose dans les bandes de la graisse à vide, de les faire pivoter de 90 degrés pour afficher les couches rétiniennes. Appuyer le plat de la membrane de nitrocellulose sur la surface de verre. Même s'il n'y a pas rétine sur chaque pièce, placez les bandes de membrane de nitrocellulose à intervalles réguliers (~ 1 mm d'intervalle) sur toute la longueur de la voie de perfusion afin de briser la tension de surface et d'améliorer l'écoulement du fluide. 2. Les enregistrements de cellules entières paires Après que toutes les tranches ont été transférés, déplacez la chambre d'enregistrement de la scène d'un montant, fixemicroscope de la scène et fixer l'électrode de plomb de référence. Concentrez-vous sur les tranches à l'aide d'une longue distance travailleur, immersion dans l'eau, 40-60X objectif. Le microscope doit être placé sur une table d'air pour amortir les vibrations et enfermé dans une cage de Faraday pour réduire les interférences électriques. Superfuse les tranches en continu à un débit de 1 ml / min avec une solution saline amphibie barboter avec 100% de O 2. Connectez l'aspiration, en s'assurant que les entrées et sorties sont équilibrées. Sortie peut être réglée par rotation de l'extrémité biseautée de l'aiguille d'aspiration ou en déplaçant le Kimwipe à l'extrémité de la chambre près ou plus loin de l'aiguille d'évacuation. La préparation peut être conservée à la température ambiante ou refroidi avec un dispositif à effet Peltier ou tout simplement par la fixation d'un sac de glace sur la platine du microscope. Examiner les tranches en faible lumière ou infra-rouge et d'identifier une paire de cellules – un photorécepteur (tige ou cône) et la cellule horizontale ou bipolaire à proximité – à la cible pour l'enregistrement de cellule entière. Tiges peuvent être iindéterminés par leurs organes de grandes cellulaires et en forme de tige segments extérieurs de premier plan (figure 2A). Les cônes sont plus petits que des tiges et ont de petits segments extérieurs coniques. Cellule bipolaire et soma des cellules horizontales sont dans la rangée extérieure de corps cellulaires dans la couche nucléaire interne (INL; figures 2B et 2C). Avant de préparer tranches, utiliser un extracteur pipette pour la fabrication de pipettes à partir de verre borosilicate (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,95 mm de diamètre intérieur avec un filament de verre). L'extrémité de chaque micropipette doit être ~ 1-2 microns de diamètre. En utilisant une aiguille de remplissage non métallique (par exemple celui fabriqué à partir d'une seringue de 1 cc ou un Microfil), remplissez pipettes avec la solution intracellulaire (tableau 1) et le fixer au porte-électrode. Élever légèrement l'objectif du microscope. Positionner la pipette de photorécepteur sous l'objectif, puis l'abaisser afin que la pointe est positionnée juste au-dessus des tranches. Répéter l'opération avec til seconde pipette. Réglez tout décalage dans le niveau actuel de référence sur l'amplificateur. Vérifier la résistance de la pipette avec une mV impulsion de dépolarisation 5-10. Nous utilisons généralement pipettes qui vont de 10 à 15 MQ, le résultat de la longue cône de l'arbre et à faible osmolarité des solutions pipette amphibiens. Avec les solutions de mammifères d'osmolarité plus, ces mêmes pipettes présentent des valeurs de résistance de ~ 8-12 MQ. Bien que nous ayons utilisé des diamètres de pointe avec des valeurs de résistance de 3-4 MQ dans les solutions d'amphibiens, les avantages offerts par une résistance d'accès inférieur sont compensées par une plus grande difficulté à étanchéité sur les membranes cellulaires et un aperçu plus rapide des courants de calcium et d'autres second messager réponses sensibles. Tout en appliquant une légère pression, la position favorable de la pipette post-synaptique afin qu'il communique avec l'organisme de cellules horizontale ou bipolaire. Ensuite, positionner la pipette présynaptique de telle sorte qu'il contacte le corps de cellule d'un photorécepteur tige ou de cône. Enregistrements appear soit plus stable lorsque les embouts de pipette contacter le segment interne plutôt que le soma, en particulier dans les cônes. Lors de la surveillance de la résistance, relâchez la pression positive sur la pipette post-synaptique. Parfois, la libération de la pression positive est suffisante pour former un joint d'étanchéité gigaohm. Sinon, appliquer une aspiration douce avec une seringue de 1 ml ou par la bouche. Après la résistance de pointe a augmenté à> 100 MQ, appliquer un potentiel de maintien de -60 mV. Après l'obtention d'un joint gigaohm, null sur les transitoires de capacité de pipette et répétez la procédure d'étanchéité pour la pipette photorécepteur, en appliquant un potentiel de maintien de -70 mV. Rupture du patch à l'aide de votre bouche ou une seringue pour appliquer une aspiration à chaque cellule à son tour. Bâtonnets, cônes et les cellules bipolaires sera typiquement rupture avec aspiration douce. L'obtention de la configuration à cellules entières avec une cellule horizontale peut nécessiter une plus grande aspiration (c'est à dire avec une seringue de 3 cc) en combinaison avec de fortes impulsions de tension rapide fourni avec le f "zapping"eature de l'amplificateur de patch-clamp. La rupture de la membrane et la mise en place de configuration de la cellule entière est évident par l'apparition de transitoires de capacité de cellule entière. Confirmer l'identité de la cellule post-synaptique physiologique en appliquant un flash de lumière et offrant une série de mesures de tension de -120 à 40 mV en incréments de 20 mV (figures 3 et 4). Pour évaluer si la paire de cellules sont synaptique reliée, de livrer un bref (25-100 msec), 60 mV étape dépolarisation au photorécepteur (à -10 mV, près de la pointe de la L-type actuel calciques voltage-dépendants) et Look pour des courants post-synaptiques dans la deuxième neurone de commande (figure 5). Une étape de dépolarisation solide doit évoquer un courant entrant rapide, transitoire post-synaptiques dans la cellule bipolaire horizontale ou OFF post-synaptique provoquée par une explosion de la libération des vésicules à partir du cône (figure 5).

Representative Results

Traces représentatif de réponses lumière de neurones en tranches verticales de salamandre rétine sont présentés dans la figure 3. Le cône, cellule horizontale, et OFF cellules bipolaires affichent tous un courant vers l'extérieur en réponse à l'apparition de la lumière. L'éminent courant entrant après le flash de lumière dans les enregistrements de cellules horizontales et bipolaire est causé par l'augmentation de la libération de glutamate par les photorécepteurs comme ils dépolarisent à compenser la lumière. La cellule bipolaire ON répond par un courant entrant à l'apparition de lumière résultant d'un récepteur métabotropique du glutamate cascade de signalisation et l'activation des canaux 9 TRPM1 signe inversion. Les cellules horizontales et les cellules bipolaires peuvent être distingués les uns des autres par leurs relations IV (figure 4). Les cellules horizontales ont typiquement une résistance d'entrée linéaire ou rectification entrante IV et faible (<500 MQ; figure 4A) alors que les cellules bipolaires ont une résistance d'entrée élevée(0,5-2 GQ) et vers l'extérieur de rectification I – V (figure 4B) La figure 5 montre des résultats représentatifs à partir d'enregistrements d'une paire de cellules de cône horizontal (figure 5A) et une paire de cellules bipolaires cône OFF (figure 5B).. Dans chaque cas, le cône de dépolarisation à -10 mV partir d'un potentiel de maintien de -70 mV évoqué un courant dans le cône vers l'intérieur et RPEC rapide dans la cellule horizontale ou bipolaire calciques voltage-dépendants. Cette forte stimulation est suffisante pour vider la piscine facilement libérable de ~ 20 vésicules à partir de chaque ruban synaptique, résultant en une RPEC de ~ 47 pA / ruban 10. L'EPSC cellulaire horizontale sur la figure 5A était de 232 pA, ce qui suggère qu'il a reçu 5 contacts ruban du cône présynaptique. Une estimation similaire du 178 pA EPSC dans la cellule bipolaire off (figure 5B) suggère qu'il a reçu 4 contacts ruban du cône présynaptique. <strong> Amphibian saline Pipette présynaptique Pipette Postsynaptic NaCl 116 mM 3,5 mM 3,5 mM KCl 2,5 mM CaCl2 1,8 mM 1 mM 1 mM MgCl2 0,5 mM 1 mM 1 mM HEPES 10 mM 10 mM 10 mM Glucose 5 mM Cs-glutamate * 40 mM Cs-gluconate ** 50 mM 90 mM le chlorure de tétraéthylammonium 10 mM 10 mM <tr> ATP-Mg 9 mm 9 mm GTP 0,5 mM 0,5 mM EGTA 5 mM 5 mM pH *** 7.8 7.2 7.2 Osmolarité **** 245 mOsm 240 mOsm 240 mOsm * Cs-glutamate est réalisée par neutralisation mM d'acide L-glutamique 40 avec 40 mM de CsOH dans la solution de la pipette. A 1 M ** magasin de Cs-gluconate est effectuée par neutralisation d'une solution de CsOH avec 45 à 50% d'acide D-gluconique. *** Le pH doit être ajusté avec NaOH à la solution extracellulaire et CsOH pour les solutions pipette. **** Garder l'osmolarité des solutions pipette juste en dessous de celle de la solution extracellulaire empêche le gonflement des cellules et améliore la longévité de l'enregistrement. Tableau1. Composants et paramètres pour les solutions intracellulaires et extracellulaires standards utilisés dans le présent protocole. Figure 1. conception de la chambre d'enregistrement. (AC) Haut, latérale et une vue en coupe de la chambre d'enregistrement indiquant les dimensions. La chambre est usiné à partir d'un morceau épais de 2 mm d'acrylique. (D) chambre assemblé. Superfusat pénètre dans la chambre par le biais d'une longueur de 10 cm d'un tube en téflon (tube d'alimentation, le type 24LW). Superfusat est éliminée par application d'une aspiration légère à un tube métallique de calibre biseauté 20 de l'autre côté de la chambre. À côté de ce tube de sortie est une électrode de référence Ag / AgCl culot. La tête de cette électrode de référence est reliée à l'entrée de référence du headstage. Un petit triangle de Kimwipeest placée sur l'électrode de référence pour le maintenir en contact avec la solution et régler le débit de la solution dans le tube d'écoulement. Le fond de la chambre est formé en plaçant une lame de microscope en verre dans les bords en retrait de la chambre. La lame est maintenue en place par un cordon de graisse à vide. Des bandes de membrane de nitrocellulose avec des tranches rétiniennes sont intégrés dans des billes de graisse à vide qui forment un canal pour solution à couler. Avant de faire des tranches, un x 10 mm morceau de membrane de nitrocellulose 5 est fixée sur la chambre avec deux petites billes de graisse à vide. Un morceau de l'œilleton est placé côté vitré bas sur cette membrane de nitrocellulose et décollée une fois la rétine adhère. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Paires de cellules remplies de teinture en vepréparation de tranches rticale. A) Images d'une barre horizontale et la cellule synaptique couplé qui ont rempli contrastant avec des colorants fluorescents introduits par la pipette de patch lors de l'enregistrement de cellule entière simultanée. Lucifer jaune (2 mg / ml) a été inclus dans la solution pipette tige (jaune) et sulfarhodamine B (1 mg / ml) a été inclus dans la solution de la pipette de cellules horizontale (violet). Des images fluorescentes ont été capturées à l'aide d'un disque en rotation microscope confocal (Perkin Elmer Ultraview LCI) équipé d'une caméra CCD refroidie (orque ER) et monté sur le microscope à platine fixe (Nikon E600 FN avec 60X, 1,0 NA objectif à immersion dans l'eau). Ces images ont été superposées sur des images de champ lumineux des tranches rétiniens correspondants en utilisant Adobe Photoshop. B) Images d'un cône et synaptiquement couplés OFF cellule bipolaire. Le terminal axone de la cellule bipolaire se ramifie dans les régions ultrapériphériques sublamina (S1) de la couche plexiforme interne près de la frontière avec la couche nucléaire interne. <strong> C) Images d'un cône et la cellule horizontale synaptique couplé. Notez que les bornes coniques sont considérablement plus grand que le terminal axone de la tige. Bien que les cellules horizontales peuvent être identifiés par la forme oblongue de leurs corps cellulaires, les corps cellulaires des ON et les cellules bipolaires hors-type dans l'INL ne peuvent pas être facilement distingués avant l'enregistrement. Cependant, on peut cibler déplacées cône chassé cellules bipolaires qui ont des corps cellulaires dans l'ONL et peuvent être distingués des cônes par l'absence de segments intérieur et extérieur. La barre d'échelle est de 20 um. Figure 3. Courants enregistrés sous la bride de tension de quatre neurones rétiniens différents en réponse à un lumineux 500 ms flash de lumière blanche lumineuse évoquée. Le cône (A), la cellule horizontale <strong> (B), et hors cellule bipolaire (C) tous répondu à la lumière avec un courant vers l'extérieur. (D) sur la cellule bipolaire a répondu à la même stimulus lumineux avec un courant entrant. Le bruit de base présenté par la cellule off bipolaire (C) reflète une libération continuelle de vésicules synaptiques dans l'obscurité qui diminue lorsque photorécepteurs hyperpolarisent à la lumière. Les réponses à ces quatre cellules ont été obtenues dans des enregistrements distincts en utilisant des tranches préparés sous une lumière blanche. L'intensité du stimulus de lumière blanche utilisée dans ces exemples produit des réponses dans les cellules horizontales et bipolaires équivalent à 580 nm flux de photons de 1 x 10 5 photons / s / um 2. Figure 4. Cette tension relations (IV) de hles cellules bipolaires orizontal et hors service. (A) panneau supérieur, les courants de membrane suscitées par une série de 150 msec tension étapes de -120 à 40 mV appliquée en 20 incréments mV (panneau de fond) vers une cellule horizontale. Les cellules horizontales ont généralement une faible résistance d'entrée et des relations linéaires IV ou de rectification vers l'intérieur (B). Relation IV d'une cellule bipolaire bloqué en réponse à une série d'échelons de tension. Cellules bipolaires ont une plus grande résistance d'entrée et un IV de rectification vers l'extérieur, du fait de l'activation des courants potassiques voltage-dépendants. Figure 5. Exemples d'enregistrement des données appariées. (A) Enregistrement du courant calcique voltage-gated cône (cône I Ca </sUB>) en réponse à une étape ms à -10 mV partir d'un potentiel de maintien de -70 mV (cône V m) 100. Fuite et la capacité transitoires ont été soustraites en utilisant un protocole soustraction de fuite P / 8. Un rapide excitateur courant post-synaptique (EPSC; HC PSC) a été enregistré en même temps à partir d'une cellule horizontale, montrant que ces deux cellules sont synaptiquement couplées (B) Une RPEC a été enregistré dans une cellule bipolaire arrêt en réponse au même stimulus à un autre. cône.

Discussion

La préparation de la tranche la rétine s'est avérée très utile pour analyser les circuits et les mécanismes utilisés par la rétine pour traiter l'information visuelle. La possibilité d'obtenir des enregistrements de cellules entières simultanément à partir de neurones pré-et post-synaptique a été particulièrement utile à cet égard. Enregistrements de cellules entières paires sont beaucoup plus faciles à réaliser avec des tranches qu'avec plate-Préparatifs pour le montage de la rétine parce que les différentes couches de la rétine sont exposées. En outre, en raison de leurs grandes neurones rétiniens, les salamandres ont une longue histoire en tant que préparation de la rétine et fournissent donc un système modèle particulièrement bien caractérisés.

Avec la pratique, tranches saines de salamandre rétine peuvent être préparés régulièrement. Quelques étapes clés peuvent faire la différence entre le succès et l'échec. 1) Assurez-vous que la lame de rasoir est monté sur la trancheuse de tissu de sorte qu'il repose à plat sur la surface du verre et des tranches proprement si les deux le tissu et underlyimembrane de nitrocellulose ng. Si vous avez fait une coupe nette à travers la membrane de nitrocellulose, vous devriez entendre un léger clic que la lame de rasoir frappe la surface de la lame de verre. 2) Assurez-vous que la rétine a adhéré à la membrane de nitrocellulose. Sinon, la rétine peut flotter loin de la membrane à n'importe quelle étape de la procédure. 3) Ne pas exposer les tranches coupées à l'air, car cela pourrait endommager la plupart des cellules superficielles. 4) Assurez-vous que les tranches et la membrane de nitrocellulose reposent à plat sur la lame de verre afin que les couches de la rétine sont visibles sous la loupe binoculaire. 5) Balance des taux d'entrée et de sortie superfusat afin d'éviter tout débordement de la chambre d'enregistrement. Cela évite des changements soudains dans les niveaux de la solution, qui peut causer des mouvements brusques de tissus. 6) Sélectionner une paire de cellules saines proches l'une de l'autre. Les cellules avec cytoplasme lisse sont en meilleure santé que les cellules avec un cytoplasme granuleux. Les cellules les plus profondes dans la tranche sont plus susceptibles de conserver intact con synaptiquetacts. 7) Assurez-vous que la pointe de la pipette n'a pas rompu ou brossé contre d'autres tissus ou de débris sur le chemin vers les cellules. 8) Vérifier la résistance pipette pour s'assurer qu'il n'est pas obstrué par des débris ou une bulle, à la fois de ce qui peut rendre difficile l'obtention d'un enregistrement cellules entières qualité.

Plutôt que de fixer la rétine de papier filtre de nitrocellulose, certains chercheurs intègrent rétines dans un bloc de gélose et utilisent un vibratome à couper des tranches rétiniennes. Bien que nous n'avons pas essayé cette approche, Kim et al. 11 discuter des avantages des deux approches. Dans leur expérience, l'approche à base de gélose fournit un rendement plus uniforme des tranches plates avec des couches rétiniennes bien délimités mais l'approche du filtre papier donne des photorécepteurs sains.

Bâtonnets et les cônes sont responsables de la transduction lumière des changements dans le potentiel de membrane. Avec les enregistrements par paires, le potentiel de membrane des tiges ou des cônes peut être manipulés directement et donc la capacité de générer des réponses lumineuses, tout en étant utiles pour identifier les types de cellules, peut-être pas indispensable. Nous préparons donc souvent tranches en lumière blanche. Cependant, même quand il est préparé sous un éclairage lumineux, les neurones rétiniens salamandres peuvent générer des réactions légères comme l'illustrent les réponses dans la figure. 3. Ceci est partiellement dû à un nombre relativement important réservoir de chromophore dans le grand volume du segment externe, mais peut aussi refléter la capacité des cellules à se régénérer Müller 11-cis-rétinal pour cônes 12. Pour obtenir des réponses lumineuses entièrement adaptés à l'obscurité, on peut préparer les tranches sous un éclairage infrarouge. Pour dissections sous la lumière infrarouge, nous attachons GenIII intensificateurs d'image (Nitemate Nav3, Litton Industries, Tempe, AZ) pour les oculaires du microscope à dissection et illuminer le tissu avec une lampe de poche LED infrarouge. Pour trancher et d'autres procédures qui sont menées sous la loupe binoculaire, nous employons un visiocasque image amplificateur. Pour le placement des pipettes de patch, nous visualisons tranches à l'aide d'une caméra CCD sensible à l'infrarouge (par exemple Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) monté à la verticale microscope, fixe la scène. Avec ces précautions, on peut obtenir des réponses de tige présentant une sensibilité unique photon 6, 13.

Une limitation de travailler en tranches rétine est que les processus cellulaires longues de grands neurones rétiniens de terrain risquent de perdre beaucoup de leurs dendrites lors de la procédure de trancher. Préparations de tranche rétiniennes sont donc plus utile pour étudier la physiologie des cellules, dans lequel les contacts synaptiques impliquant des processus près du corps de la cellule. Rétines d'amphibiens et de mammifères partagent plusieurs des mêmes types de cellules et utilisent des mécanismes physiologiques similaires 14-16. Alors que la salamandre rétine est un bon modèle pour de nombreux aspects de la rétine des mammifères, une différence importante semble être la présence d'une voie de tige dédié chez les mammifères qui involves contacts des cellules bipolaires tige spécialisées sur les cellules AII amacrine 14. Une autre limite de la rétine salamandre est le petit nombre d'outils génétiques développés spécifiquement pour cette espèce. Cependant, les anticorps et les réactifs shRNA qui ciblent des régions bien conservées dans d'autres espèces peuvent être utilisés avec succès dans salamandre, tout comme de nombreux inhibiteurs de petites molécules et des réactifs peptidiques. En outre, avec quelques modifications dans la technique, des tranches rétiniennes peuvent être préparés à partir d'autres espèces dans lequel certains de ces outils sont plus facilement disponibles.

Au-delà de son utilité pour l'enregistrement de cellule entière jumelé, la préparation de tranches rétinienne salamandre est également prête à une variété d'autres approches. Comme indiqué ci-dessus, des tranches rétiniennes peuvent être utilisées pour étudier les réponses de lumière en combinaison avec différents protocoles de serrage de tension 17. Neurones rétiniens peuvent aussi être chargés avec des colorants fluorescents sensibles au Ca 2 +, Cl -, ou Na+ Introduit par la pipette de patch ou par bain-application 15,18-20. Un peptide fluorescent qui se lie au ruban synaptique 21 peut être introduit à travers la pipette de patch et utilisée pour l'imagerie du ruban 10, ou, lorsqu'il est conjugué à la fluorescéine, de façon aiguë et d'endommager sélectivement le ruban 22. Nous avons également utilisé des tranches rétiniennes en combinaison avec des points quantiques pour surveiller les mouvements des canaux calciques individuels à bâtonnets et des cônes terminaisons synaptiques 23. Ainsi, la tranche verticale rétinienne est une préparation expérimentale polyvalente pour l'étude des mécanismes synaptiques de base et des fonctions de traitement spécifiques effectuées lors de la première synapse de la voie de signalisation visuelle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la recherche pour prévenir la cécité et Institutes of Health subvention EY10542 nationale.

Materials

Name of the reagent/material Company Catalogue number Comments (optional)
Tissue slicer Stoelting 51425
Double edge razor blades Ted Pella, Inc 121-6
Nitrocellulose membranes Millipore AAWP02500 Type AAWP 0.8 mm pore
Borosilicate glass pipettes World Precision Instruments TW120F-4 1.2mm OD 0.95 mm ID
Ag/AgCl pellet Warner E206
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 34 ga. Filling needle, 67 mm long
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References

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Van Hook, M. J., Thoreson, W. B. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007, doi:10.3791/50007 (2013).
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