準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

1。全血採取ローカル採血ガイドラインに従って設定し450ミリリットルトップ/ボトムコレクションのボランティアドナーからの全血を収集します。 全血を遠心分離し、分離前の冷却板上に2時間の最小値が格納される。 2。バフィーコートの調製赤血球、バフィーコート、および血漿：3つの層に血液を分離するのは難しいスピンを用いた全血を遠心分離します。使用される遠心分離機パラメータは±2℃22℃11分間4880 RCFあっ収集容器に軟膜を残して、トップのサテライトバッグと下部のサテライトバッグに赤血球（RBC）にプラズマを表現するために自動化された血液·セパレータを使用します。軟膜のボリュームとヘマトクリット値の範囲は、それぞれ約48ミリリットルと37％であるという意味でターゲットにしています。 バフィーコートは22±2℃で血小板アジテータを一晩保存されている<p clasS = "jove_title"> 3。軟膜プーリング列車の長さを削減するための無菌接続7軟膜との平行線を持つ列車構成でSSP +血小板添加溶液（PAS）の300ミリリットル、PASは、列車の先頭でなければなりません。 PASと第一軟膜の間のラインをクランプします。 軟膜ユニット間の無菌接続を開き、軟膜は最後のコンテナに排出することができます。 溶接とPAS最初の軟膜の間にクランプを開きます。添加液の3分の1が連続して軟膜コンテナのそれぞれを介してリンスすることができます。 2回以上残っているPASの半分を使用して、それぞれの時間を繰り返します。 平均バフィーコート·プール·ボリュームは、約600ミリリットルである必要があります。後の工程でINTERCEPT病原体不活化処理の必要に応じて、47パーセント – 個々の軟膜のターゲット·ボリュームとヘマトクリット値が満たされている場合、血漿比は32となります。 空のSSP +およびバフィを破棄コー​​トコンテナ。 最適な血小板の回復については、遠心分離前に1時間のアジテータをプールしておく。 無菌バフィーコート·プールに統合された白血球除去フィルターを用いて血小板貯蔵容器に接続してください。 懸濁液中の血小板（9分、20秒462 RCF）から赤血球を分離するバフィーコート·プールの "ソフトスピン"を行う。血小板保存容器に白血球除去フィルターを介して自動化された血液分離装置を用いて血小板懸濁液を表明。 420ミリリットルの容積、2.5から7.0×10 11血小板用量、≤4×10 6 / mlの赤血球-前述の処理要件は血小板懸濁液を300ミリリットルのインターセプト処理の仕様を満たしていることを確認してください。 4。インターセプト処理採取後1日目の終わり（0日目は、コレクションの日です）の前にインターセプト処理を実行します。 INTERCEPT処理セットをアンラップ透明なプラスチック袋からデュアルストレージコンテナを持つ。 無菌INTERCEPT処理セットでamotosalen容器のチューブに血小板懸濁液の容器を接続します。 ローカル要件に従って適切な血液製剤の識別とINTERCEPT処理セット貯蔵容器にラベルを付けます。 血小板をハングアップし、照明容器に流入amotosalenソリューションを可能にする、第一amotosalen容器の底カニューレを破る。血小板は照明容器にamotosalenコンテナを通して流すことamotosalenコンテナの上部カニューレを破る。 優しく血小板とamotosalen混合物を混ぜるとam​​otosalen容器内に照射容器から空気を表現しています。 チューブの約4cm充填、チューブに血小板混合物の少量を表現しています。これは、チューブや照明コンテナの両方で血小板が病原体inactivati​​を受け確実に治療について。 照明容器とamotosalenコンテナ間のチューブをシールします。照明コンテナから伸びるチューブの約4 cm以上のものを残しなさい。取り外して捨てる空の血小板とamotosalenコンテナを、サンプリング·ポーチにクランプを閉じます。 左側の大きなコンパートメント内の照明容器と右側の小さいコンパートメントにオーガナイザーとイルミに設定された処理を配置します。 寄付先ID、製品コード、および照明に処理セットのロット番号を入力するハンドヘルドバーコードデバイスを使用しています。金属製のカバーを閉じて、照明のグラフィカルインターフェイスでプロンプトが表示されたときに、引き出しを閉める。イルミネーションを開始するために "Start"を押してください。 照射後に、照明装置から処理セットを削除します。照明は自動的に処理された血小板の単位（s）の治療レポートを印刷します。 主催者からの容器を開けて、電話をハングlateletsと処理セットは、照明容器の出口にカニューレを破ると、血小板は化合物吸着装置（CAD）容器に流れるようになります。 プラズマ抽出器を用いて照明容器にCAD容器から空気を表現し、CADのウエハを曲げないように注意しながら。 CADの容器の入口ポートに近いチューブをシールします。空の照明容器を取り外して廃棄します。 少なくとも6時間、血小板上のアジテーターに接続されたストレージ·コンテナーを使用するCADコンテナが、以上16時間を置きます。これは≤2μMの濃度に残留amotosalenの削減になります。 CADデータを処理した後、アジテータから血小板ユニットを取り外します。血小板をハングアップする。カニューレを破ると、血小板は貯蔵容器に流れるようになります。 CADの容器に貯蔵容器から空気を表現しています。残留濃厚血小板フローバック貯蔵容器内でみよう重力。 Y字フィッティング上記チューブを密封し、空のCADデータコンテナを削除します。 必要に応じて貯蔵容器の間に再配布するボリューム。ボリューム調整は貯蔵容器を計量することによって作られています。数センチ貯蔵容器の入口上記の各貯蔵容器にチューブを密封、これは5.2で説明したように最終製品から無菌のサンプルを得ることが容易になります。 5。製品のサンプリングルーチンQCテストでは、最終貯蔵容器は、貯蔵容器に採取袋を使用して一度にサンプリングすることができます。これを行うには、血小板ユニットがうまくミックスされていることを確認してから、袋にクランプを開いて、数回絞る。ポーチは、血小板で満たされた後、チューブをシールします。適切な実験チューブに血小板試料を移し、すぐにアッセイを行う。 このような検証研究用として、記憶の過程で複数の時点でサンプルを得るために、無菌接続血小板貯蔵容器のチューブに新しいサンプリング容器。血小板が十分にサンプリングコンテナに転送する前に混合していることを確認します。 6 in vitroでの機能評価この検証研究では、in vitroでの評価は、CAD治療（1日目または2日目に、CAD期間によって異なります）の後に実行し、再び4日目（または5日目）と7日目にしました。vitroでの測定で容積、血小板数、pHを、含まれている血液ガス（PO 2、PCO 2）、グルコース、乳酸、と渦巻く。 ボリュームは添加剤溶液中の血小板の比重として1.01グラム/ mlを使用して重量を測定した。 ヘモグロビン汚染は視覚的にカラーチャートとの比較を用い​​て評価した。 旋回は、視覚的に決定した。 他のアッセイの方法論については、 "機器のテーブル"を参照してください。 7。代表的な結果 Dの製造プロセスouble用量軟膜の血小板は、ボリュームおよびヘマトクリットの目標仕様を満たす個々の軟膜の生産から始まります。それが最終的なプロセスの検証中に、個々の軟膜のヘマトクリット値を測定することは現実的ではないので、我々は一貫してターゲット·ボリュームとヘマトクリット値を満たすことができることを確認するために私達の軟膜を最適化するために独立した努力を行うことによって始まった。 表1に示すように、我々の最適化されたバフィーコートは46でボリュームおよびヘマトクリット両方±2 mlおよび37±3％、それぞれの目標値に好意的に比較した。 プーリング後、バフィーコート·プールのボリュームおよびヘマトクリットは、それぞれのソフトスピン遠心分離前に約600ミリリットルと20％であるべきである。 表2に示すように、私たちの軟膜プールは615を平均±5ミリリットルを、ヘマトクリット値は19を平均±1％。 二重線量血小板の濃ソフトスピン遠心結果INTERCEPT血液系のDS処理セットを利用病原体不活化のための入力要件を満たすことentrate。インターセプト処理用キーの入力パラメータは、ボリューム、血小板数、血漿比、およびRBCコンテンツが含まれています。加えて、我々は軟膜プールに比べて濃厚血小板の血小板の≥75％を回収することを目指しています。地域の要件ごとに、白血球（WBC）の汚染は、<1×10 6 /ユニットでなければなりません。血小板は、私たちの検証に集中し、表3に示すように、インターセプト処理だけでなく、WBC汚染および血小板回復のための目標の重要なパラメータに会った。 病原体不活化のためのプロセスは、単一INTERCEPTインターセプト処理セットを使用して二重線量濃縮血小板上で実行されます。処理セットは、処理ユニットはパスが完了した時点で2個々の治療血小板用量に分割することを可能にする2つの積分の貯蔵容器が含まれていますプラスミン不活化プロセス。ヨーロッパのガイドラインでは、テストユニットの75％が治療dose1当たり≥200×10 9血小板が含まれていることを必要とします。スウェーデンのローカルな要件は、試験したユニットの75％は投与量当たり> 240×10 9血小板が含まれている必要があります。インターセプト処理後、平均血小板含有量は265であった±22×10 9（N = 24）。さらに、ユニットの88％が治療用量当たり240×10 9血小板を達するか、それを超えるが、これは欧州のガイドラインとスウェーデンの規制の両方の範囲内である。それぞれ二重線量バフィーコートの調製およびインターセプト処理プロセスの図については図1および2を参照してください。 この検証のために、私たちは、血小板のin vitroでの特性を測定したインターセプト処理（個々の貯蔵容器に分割した後IE）の後に集中して、パラメータは、記憶の7日間にわたって測定した。平均値と標準偏差がのために収集した血小板投与量は、pH、PO 2、PCO 2、乳酸生産とグルコース消費。 図3は、ストレージの7日間のインターセプト処理後の分割の各製品でインターセプト処理と平均血小板投与前に二重線量濃厚血小板の血小板開始用量の平均を示しています。貯蔵中の血小板の損失は約9％であった。この減少は、従来の血小板の貯蔵中の血小板の期待損失と変わりません。2 表4は、単一のユニットに分割し、分割後の治療INTERCEPT血小板のin vitroでの特徴をまとめたものです。 欧州の要件ごとに、血小板のpHは貯蔵寿命の終わりを通って6.4以上を保つ必要があります。処理中に、血小板のpHはわずかに血小板濃度、体積、および血小板STOのガス透過性に基づいてドロップ集中怒りコンテナ図4は、ストレージの7日間の分割血小板製剤のpHを示しています。貯蔵中に、pHが安定しており、うまく処理要件の範囲内で維持した。 として図5Aおよび図5Bに示すように、血小板O 2消費量とCO 2産生は、ストレージの7日間にPL2410容器の切片血小板による継続的な呼吸を示す。 図6Aおよび図6Bは、ストレージの7日間乳酸とグルコースレベルを示す。血小板のグルコース消費と乳酸生産は、ストレージの7日間に互いに整合している。 5単位は1.11 mmol / lの（グルコースアッセイの下限値）未満の血糖値を持っていた。 具体的には、ボリューム、血小板数、血漿比、赤BL、バフィーコートの調製およびプーリング検証生産血小板がインターセプト処理のための入力基準を満たしている集中OOD細胞汚染。最後のユニットは血小板用量およびpHなどのストレージの7日間にわたって検証基準を満たした。 パラメーター 対象範囲 結果は平均値±SDを 体積（ml） 〜48 46±2 ヘマトクリット値（％） 〜37 37±3 プール前のホールド時間アジテーター上で一晩アジテーター上で一晩 表1個々の軟膜（N = 19）の特性。 パラメーター 対象範囲 結果は平均値±SDを 体積（ml） 〜600 615±5 ヘマトocrit（％） 〜20 19±1 遠心前のホールド時間アジテーターで1時間アジテーターで1時間 表2。バフィーコート·プールの特性（n = 12）で。 パラメーター ターゲット 結果は平均値±SDを 体積（ml） 370から420 404±8 血小板数（×10 9 /ユニット） 250から700 577±62 血小板回収率（％）を意味する ≥75 75±4 血漿比（％） 32から47 38±1 RBC（×10 6個 / ml） ≤4 1.2±0.4 WBC（×10 6 </s> /ユニットまで） ≤1 0.11±0.1 INTERCEPT（HR）までの時間を保持する 1日目の終わり≤ 1日目の終わり≤ 表3。ダブル線量血小板の特性（n = 12）に集中している。 平均値±SD ミン マックス 体積（ml） 199±16 182 236 血小板数（×10 9 /ユニット） 265±22 225 292 pH値（22℃） 6.9±0.1 6.8 7.0 PO 2（kPa）で 21.4±4.8 12.8 27.3 PCO 2（kPa）で 4.3＆PLusmn; 0.4 3.3 4.9 乳酸（ミリモル/リットル） 9.1±1.7 6.8 12.4 グルコース（mmol / L）を 5.3±0.9 3.7 6.5 INTERCEPT処理された血小板の日1月2日（シングルユニットは、n = 24）の表4。特性。 図1 7軟膜のプールから二重線量血小板濃縮物の生産。 図2インターセプト血液システムを持つ二重線量血小板濃縮物の病原体不活化。 図3：前と線量のための血小板の平均インターセプト処理7日後（切片前にN = 12; INTERCEPTの後にn = 24）。 図4：インターセプト治療（N = 24）の後に血小板pHは平均±SD。 図5Aは。インターセプト治療（N = 24）の後pO 2は平均±SD。 図5Bは。インターセプト治療（N = 24）の後pO 2は平均±SD。 図6Aは、インターセプト治療（N = 24）の後に乳酸濃度平均値±SD。 図6Bは、。＆血糖値を平均plusmn、SDインターセプト治療後に（n = 24）。