Voorbereiding en pathogeeninactivatie van Double Dose Buffy Coat bloedplaatjesproducten met behulp van het INTERCEPT Blood System

1. Hele bloedafname Verzamel volledig bloed van vrijwillige donoren in 450 ml boven / onder collectie stelt volgens de lokale bloedafname richtlijnen. Het bloed wordt opgeslagen gedurende ten minste 2 uur op een koelplaat vóór centrifugatie en scheiding. 2. Buffy Coat Voorbereiding Centrifugeer het volbloed met een harde rotatie om het bloed gescheiden in drie lagen: rode bloedcellen, buffy coat en plasma. Centrifuge gebruikte parameters waren 4880 RCF gedurende 11 min bij 22 ± 2 ° C. Een geautomatiseerd bloedscheider de plasma drukken in de bovenste satellietzak en de rode bloedcellen (RBC) in de onderste satellietzak, waarbij de bufferlaag in de verzamelcontainer. Target betekenen volume en hematocriet bereiken voor buffy coats zijn ongeveer 48 ml en 37%, respectievelijk. De buffy-coats worden overnacht opgeslagen op een bloedplaatjes roerder bij 22 ± 2 ° C. <p class = "jove_title"> 3. Buffy Coat Pooling Steriele connect 7 buffy coats en 300 ml SSP + bloedplaatjes bewaarvloeistof (PAS) in een trein configuratie met parallelle lijnen aan de treinlengte verminderen; de PAS moet aan de bovenkant van de trein. Klem de lijn tussen de PAS en de eerste buffy coat. Open de steriele verbindingen tussen de buffy coat eenheden en laat de buffy coats op afwateren in de laatste container. Open de las en de klem tussen de PAS en de eerste bufferlaag. Toestaan ​​een derde van de bewaarvloeistof opeenvolgend spoelen door elk van de buffy coat containers. Herhaal 2 keer met telkens de helft van de resterende PAS. De gemiddelde buffy coat zwembad volume moet ongeveer 600 ml te bedragen. Als het doelvolume en de hematocriet van het individu buffycoats wordt voldaan, zal de plasma-ratio zijn 32 – 47%, zoals vereist voor het INTERCEPT pathogeeninactivatie behandeling later in het proces. Gooi de lege SSP + en buffycoat containers. Voor een optimale herstel van de bloedplaatjes, houden het zwembad op het roerwerk gedurende 1 uur voorafgaand aan de centrifugeren. Steriele sluit een bloedplaatjes opslagcontainer met geïntegreerde leukoreduction filter om de buffy coat zwembad. Voer een "soft spin" van de bufferlaag pool om de rode bloedcellen te scheiden van de bloedplaatjes in suspensie (462 RCF gedurende 9 min, 20 sec). Druk de suspensie van bloedplaatjes met behulp van een geautomatiseerd bloedscheider door het leukoreduction filter in de bloedplaatjes opslag container. De eerder beschreven verwerking voorschriften ervoor zorgen dat de bloedplaatjes schorsing van het INTERCEPT verwerking specificaties van 300 ml voldoet – 420 ml volume, +2.5-+7.0 x 10 11 bloedplaatjes dosis, en ≤ 4 x 10 6 / ml rode bloedcellen. 4. Behandeling met INTERCEPT Voer de INTERCEPT behandeling voor het einde van dag 1 na inzameling (dag 0 is de dag van de winning). Haal de INTERCEPT Processing Setmet Dual Storage Containers van de doorzichtige plastic zak. Steriele sluit de bloedplaatjes schorsing container naar de slang van de amotosalen container op de INTERCEPT verwerking set. Label de INTERCEPT verwerking set opslagcontainers met de juiste bloedproduct identificatie na lokale voorschriften. Hang de bloedplaatjes en breken eerst de onderste canule op amotosalen container, waardoor de amotosalen oplossing te stromen in de belichtingszak. Breek het topje canule op de amotosalen container waardoor de bloedplaatjes om door de amotosalen container stromen in de belichtingszak. Meng voorzichtig de bloedplaatjes en amotosalen mengsel en drukken de lucht uit de belichtingszak in de amotosalen container. Drukken een kleine hoeveelheid bloedplaatjes mengsel in de buis, vult ongeveer 4 cm van de buis. Dit zorgt voor bloedplaatjes in zowel de slang en belichtingszak ondergaan de ziekteverwekker inactivatiop de behandeling. Sluit de slang tussen de belichtingszak en amotosalen container. Reactie niet meer dan ongeveer 4 cm van de slang zich uitstrekt vanaf de belichtingszak. Verwijder de lege bloedplaatjes en amotosalen containers en sluit de klemmen op de bemonstering zakjes. Plaats de bewerkingsset in de lamp met de belichtingszak in het grote compartiment aan de linkerkant en de organisator in het kleinere compartiment aan de rechterkant. Gebruik de hand-held barcode apparaat om de donatie ID, productcode, en de verwerking set lotnummer in de verlichting in te voeren. Sluit de metalen kap en wanneer u wordt gevraagd op de illuminator grafische interface, sluit de lade. Druk op "Start" om de verlichting te starten. Na verlichting, verwijder de verwerking set van de lichtbron. De verlichting wordt automatisch afgedrukt de behandeling rapport voor de behandelde bloedplaatjes unit (s). Haal de containers van de organisator en hang de platelets en bewerkingsset, breken de canule aan de uitgang van het belichtingsstelsel container en laat de plaatjes te stromen in de verbinding adsorptie inrichting (CAD) container. Zorg ervoor dat u de CAD-wafer buigen, de lucht drukken van de CAD-container in de belichtingszak met behulp van een plasma afzuigkap. Dicht de slang nabij de inlaatpoort van de CAD container. Verwijder de lege belichtingszak. Plaats de houder met het CAD aangesloten opslag containers op bloedplaatjes roerder gedurende ten minste 6 uur, maar niet meer dan 16 uur. Dit zal leiden tot vermindering van residuele amotosalen tot een concentratie van ≤ 2 uM. Na CAD behandeling, verwijdert u de bloedplaatjes eenheden van het roerwerk. Hang de bloedplaatjes. Breek de canule en laat bloedplaatjes te stromen in de opslag van containers. Druk de lucht uit de voorraadvaten in de CAD container. Laat de resterende bloedplaatjes concentraat, terugstromen in de opslag van containers doorzwaartekracht. Sluit de buis boven het Y-stuk en verwijder de lege CAD container. Verdeel het volume tussen de voorraadvaten indien nodig. Volume-aanpassingen zijn gemaakt door het wegen van de opslag van containers. Dicht de slang elke voorraadhouder enkele centimeters boven de inlaat van het voorraadvat en dit vergemakkelijkt het verkrijgen van een steriele monster van het eindproduct zoals beschreven in 5.2. 5. Product Sampling Voor routine QC testen, kan de definitieve opslag containers eenmaal bemonsterd met de sampling zakje op de voorraadvaten. Om dit te doen, zorgen voor de bloedplaatjes-eenheid is goed gemengd, open de klem om de zak en knijp meerdere keren. Sluit de slang na de zak is gevuld met bloedplaatjes. Breng de bloedplaatjes monster in een geschikt laboratorium buis en onmiddellijk uit te voeren testen. Om monsters te verkrijgen op verschillende tijdstippen in de loop van opslag, zoals voor een valideringsonderzoek steriel verbindeneen nieuwe bemonstering container naar de slang van de bloedplaatjes opslagcontainer. Ervoor zorgen dat bloedplaatjes voorafgaand gemengd over te dragen aan de bemonstering container. 6. In vitro evaluatie Functie Voor deze validatie studie werd in vitro evaluatie uitgevoerd na CAD behandeling (dag 1 of dag 2, afhankelijk van CAD ​​duur) en nogmaals op dag 4 (of Dag 5) en dag 7. In vitro metingen inbegrepen volume, het aantal bloedplaatjes, pH, bloedgas (pO 2, pCO 2), glucose, lactaat, en zwenken. Volume werd bepaald door het gewicht met 1,01 g / ml als de dichtheid van bloedplaatjes in bewaarvloeistof. Hemoglobine besmetting werd visueel geëvalueerd met behulp van vergelijking met een kleurenkaart. Wervelende werd visueel bepaald. Zie "Tabel van apparatuur" voor de methodologie van andere testen. 7. Representatieve resultaten De aanmaak van double dosis buffy coat bloedplaatjes begint met de productie van afzonderlijke buffy coats die gericht specificaties voor volume en hematocriet. Aangezien het niet praktisch is om de hematocriet van het individu buffycoats meten tijdens de finale procesvalidatie, begonnen we door het verrichten van een aparte inspanning om onze buffy coats te optimaliseren om ervoor te zorgen dat we konden consequent doelvolume en hematocriet te voldoen. Zoals getoond in Tabel 1, onze geoptimaliseerde buffy coats gunstig vergeleken met de streefwaarden voor volume en hematocriet op 46 ± 2 ml en 37 ± 3%, respectievelijk. Na pooling dient het volume en hematocriet van de buffy coat pool is ongeveer 600 ml en 20% respectievelijk voor de zachte rotatie centrifugeren. Zoals weergegeven in tabel 2, onze buffy coat pools gemiddeld 615 ± 5 ml, de hematocriet gemiddeld 19 ± 1%. De zachte spin-centrifugeren resulteert in een dubbele dosis van bloedplaatjes concEntrate die zal voldoen aan de input voor pathogeeninactivatie gebruik te maken van het INTERCEPT Blood System DS verwerking set. Belangrijke input parameters voor INTERCEPT behandeling onder meer volume, bloedplaatjes, plasma-ratio, en RBC inhoud. Bovendien willen we ≥ 75% van de bloedplaatjes in de bloedplaatjes concentraat terug ten opzichte van de bufferlaag pool. Per lokale eisen, moet de witte bloedcellen (WBC) verontreiniging zijn <1×10 6 / unit. De bloedplaatjesconcentraten in onze validatie de belangrijkste parameters voldaan INTERCEPT behandeling en de doelstellingen voor WBC vervuiling en trombocytenherstel zoals getoond in Tabel 3. De werkwijze voor INTERCEPT pathogeeninactivatie wordt uitgevoerd op een dubbele dosis trombocytenconcentraat met een INTERCEPT bewerkende set. De verwerking set bevat twee geïntegreerde opslagcontainers waardoor het behandelde apparaat te splitsen in twee afzonderlijke therapeutische doses bloedplaatjes bij de voltooiing van de baanOgen inactivatie proces. Europese richtlijnen vereisen dat 75% van de geteste apparatuur ≥ 200×10 9 bloedplaatjes bevatten per therapeutische dose1; lokale vereisten in Zweden eisen dat 75% van de geteste eenheden bevatten> 240×10 9 bloedplaatjes per dosis. Na behandeling met INTERCEPT de gemiddelde trombocytengehalte was 265 ± 22 x10 9 (n = 24). Bovendien, 88% van de eenheden bereikt of overtroffen 240×10 9 bloedplaatjes per therapeutische dosis, dit is ruim binnen zowel de Europese richtlijnen en de Zweedse regelgeving. Zie de figuren 1 en 2 voor een illustratie van de dubbele dosis buffy coat preparaat en INTERCEPT behandelingsprocessen respectievelijk. Voor deze validatie, maten we de in vitro eigenschappen van de bloedplaatjesconcentraten na INTERCEPT behandeling (dat wil zeggen na de splitsing in de individuele opslag van containers); parameters werden gemeten over 7 dagen opslag. Gemiddelde en standaardafwijking werden verzameldbloedplaatjes dosis, pH, pO 2, pCO 2, lactaat productie en glucose verbruik. Figuur 3 toont de gemiddelde bloedplaatjes dosis vanaf de dubbele dosis bloedplaatjesconcentraat voor INTERCEPT behandeling en het gemiddelde bloedplaatjesvolume dosis in elk van de gesplitste producten na INTERCEPT behandeling gedurende 7 dagen opslag. Bloedplaatjes verlies tijdens opslag was ongeveer 9%. Deze vermindering is niet anders dan het verwachte verlies van bloedplaatjes tijdens de opslag van conventionele plaatjes. Twee Tabel 4 vat de in vitro eigenschappen van de INTERCEPT bloedplaatjes na behandeling en splitsen in afzonderlijke eenheden. Per Europese eisen, moet de pH van bloedplaatjes blijven boven 6,4 door het einde van de houdbaarheidstermijn. Tijdens de verwerking, de pH van de bloedplaatjesconcentraten iets daalt gebaseerd op de concentratie van bloedplaatjes, volume en de gaspermeabiliteit van de bloedplaatjes storage container. Figuur 4 illustreert de pH van de split bloedplaatjesproducten over 7 dagen opslag. Tijdens de opslag de pH stabiel en goed onderhouden binnen de verwerkingseisen. Zoals getoond in figuren 5A en 5B, de bloedplaatjes O 2 verbruik en de CO 2 dan verder door de ademhaling INTERCEPT bloedplaatjes in de PL2410 container gedurende 7 dagen opslag. Figuren 6A en 6B tonen het lactaat en glucose niveaus gedurende 7 dagen opslag . Bloedplaatjes glucose consumptie en lactaat productie zijn consistent met elkaar tijdens de 7 dagen van de opslag. 5 eenheden had glucose niveau minder dan 1,11 mmol / l (de ondergrens voor de glucose assay). De buffy coat voorbereiding en bundeling validatie geproduceerd bloedplaatjesconcentraten die voldeden aan de criteria voor de ingang INTERCEPT behandeling, met name, het volume, het aantal bloedplaatjes, plasma-ratio, en rood blood cel contaminatie. De laatste eenheden de validatie criteria voldaan dan 7 dagen opslag waaronder bloedplaatjes dosering en pH. Parameter Doelbereik Resultaten Gemiddelde ± SD Volume (ml) ~ 48 46 ± 2 Hematocriet (%) ~ 37 37 ± 3 Houd tijd voor bundeling van Overnachting aan roerwerk Overnachting aan roerwerk Tabel 1. Kenmerken van de individuele Buffy Coats (n = 19). Parameter Doelbereik Resultaten Gemiddelde ± SD Volume (ml) ~ 600 615 ± 5 Hematocrit (%) ~ 20 19 ± 1 Houd tijd voordat centrifugeren 1 uur op agitator 1 uur op agitator Tabel 2. Kenmerken van de Buffy Coat Pools (n = 12). Parameter Doel Resultaten Gemiddelde ± SD Volume (ml) 370-420 404 ± 8 Bloedplaatjes (x10 9 / eenheid) 250-700 577 ± 62 De gemiddelde herstel van de bloedplaatjes (%) ≥ 75 75 ± 4 Plasma ratio (%) 32-47 38 ± 1 RBC (x10 6 / ml) ≤ 4 1,2 ± 0,4 WBC (x10 6 </sup> / eenheid) ≤ 1 0,11 ± 0,1 Houd tijd voordat INTERCEPT (uur) ≤ einde van dag 1 ≤ einde van dag 1 Tabel 3. Kenmerken van de dubbele dosis bloedplaatjesconcentraten (n = 12). Gemiddelde ± SD Min Max Volume (ml) 199 ± 16 182 236 Bloedplaatjes (x10 9 / eenheid) 265 ± 22 225 292 pH (22 ° C) 6,9 ± 0,1 6,8 7,0 pO 2 (kPa) 21,4 ± 4,8 12,8 27,3 pCO 2 (kPa) 4,3 & plusmn; 0,4 3,3 4,9 Lactaat (mmol / l) 9,1 ± 1,7 6,8 12,4 Glucose (mmol / l) 5,3 ± 0,9 3,7 6,5 Tabel 4. Kenmerken van het INTERCEPT behandelde bloedplaatjes Dag 1/2 (Single-eenheden, n = 24). Figuur 1. Productie van een dubbele dosis trombocytenconcentraat uit een pool van 7 buffy coats. Figuur 2. Pathogeeninactivatie van een dubbele dosis van bloedplaatjes concentraat met het INTERCEPT Blood System. Figuur 3. Gemiddelde bloedplaatjesvolume dosis voor en7 dagen na INTERCEPT behandeling (n = 12 voor INTERCEPT; n = 24 na INTERCEPT). Figuur 4. Gemiddelde bloedplaatjesvolume pH ± SD na INTERCEPT behandeling (n = 24). Figuur 5A. Gemiddelde ± SD pO 2 na INTERCEPT behandeling (n = 24). Figuur 5B. Gemiddelde ± SD pO 2 na INTERCEPT behandeling (n = 24). Figuur 6A. Gemiddelde ± SD lactaatniveaus na INTERCEPT behandeling (n = 24). Figuur 6B. Gemiddelde glucosespiegels &plusmn; SD na INTERCEPT behandeling (n = 24).