Vorbereitung und Pathogeninaktivierung von Double Dose Buffy Coat Platelet Produkte, die INTERCEPT Blood System

Ein. Vollblutspende Vollblut von freiwilligen Spendern in 450 ml oben / unten Kollektion setzt nach den örtlichen Blutentnahme Richtlinien. Das Vollblut für mindestens 2 Stunden auf einer Kühlplatte vor der Zentrifugation und Abtrennung gespeichert. 2. Buffy Coat Vorbereitung Zentrifuge das Vollblut mit einem harten Spin um das Blut in drei Schichten trennt: rote Blutkörperchen, Leukozytenfilm und Plasma. Zentrifuge verwendeten Parameter waren 4880 RCF für 11 min bei 22 ± 2 ° C. Verwenden eines automatisierten Bluttrenneinheit um das Plasma in den oberen Satellitenbeutel und die roten Blutkörperchen (RBC) in den unteren Satellitenbeutel ausdrücken, so dass der Leukozytenmanschette in dem Sammelbehälter. Ziel bedeuten, Volumen und Hämatokrit Bereiche für buffy coats ca. 48 ml und 37%, bzw. sind. Die Buffy-Coats werden über Nacht auf einem Plättchen Rührwerk bei 22 ± 2 ° C gelagert <p class = "jove_title"> 3. Buffy Coat Pooling Sterile connect 7 buffy coats und 300 ml SSP + Plättchen-Additiv-Lösung (PAS) in einem Zug Konfiguration mit parallelen Linien zur Verringerung der Zuglänge, die PAS sollte an der Spitze des Zuges. Klemmen Sie die Leitung zwischen dem PAS und der ersten Buffy-Coat. Öffnen die sterile Verbindung zwischen den Leukozytenfilm Einheiten und damit das buffy coats, in den letzten Behälter abzulassen. Öffnen Sie die Schweißnaht und die Klammer zwischen der PAS und der ersten Buffy-Coat. Erlauben einem Drittel des Additivs Lösung durch jedes der Leukozytenmanschette Behälter nacheinander zu spülen. 2 weitere Male wiederholen, wobei jedes Mal eine Hälfte des verbleibenden PAS. Die durchschnittliche Leukozytenfilm Pool Volumen sollte ca. 600 ml sein. Wenn das Zielvolumen und Hämatokrit der einzelnen buffy coats erfüllt sind, wird die Plasma-Verhältnis um 32 – 47% für die INTERCEPT Pathogeninaktivierung Behandlung später im Prozess erforderlich. Entsorgen Sie die leere SSP + und buffyMantel Behältern. Für eine optimale Plättchenregenerationsrate, halten den Pool auf dem Rührwerk für 1 Stunde vor dem Zentrifugieren. Sterile Verbindung ein Plättchen Vorratsbehälter mit integriertem Leukoreduktionsfilter der Buffy-Coat-Pool. Durchführen einer "soft spin" der Leukozytenmanschette-Pool, um die roten Blutkörperchen von den Plättchen in Suspension (462 RCF für 9 min, 20 sec) zu trennen. Hilfestellung Blutplättchensuspension Verwendung eines automatisierten Bluttrenneinheit durch die Leukoreduktionsfilter in die Blutplättchen Vorratsbehälter. Die zuvor beschriebenen Anforderungen an die Verarbeitung sicherzustellen, dass der Plättchensuspension dem Zwischenverarbeitungsuntersystem Spezifikationen von 300 ml entspricht – 420 ml Volumen, 2,5 bis 7,0 x 10 11 Blutplättchen Dosis und ≤ 4 x 10 6 / ml Erythrozyten. 4. INTERCEPT-Behandlung Führen Sie die INTERCEPT Behandlung vor dem Ende von Tag 1 nach der Entnahme (Tag 0 ist der Tag der Sammlung). Packen Sie das INTERCEPT Verarbeitung Setmit Dual Storage Containers aus dem klaren Plastikbeutel. Sterile verbinden Blutplättchensuspension Behälter zu dem Rohr des Behälters auf der Amotosalen INTERCEPT Verarbeitungssatzes. Beschriften Sie die INTERCEPT Verarbeitungssatzes Lagerbehälter mit dem entsprechenden Blutprodukt Identifizierung nach lokalen Anforderungen. Hängen Sie die Blutplättchen und brechen zuerst die unteren Kanüle auf dem Amotosalen Behälter, so dass die Amotosalen Lösung fließen in die Beleuchtung Behälter. Break the top Kanüle auf dem Amotosalen Behälter so dass die Blutplättchen durch die Amotosalen Behälter in der Beleuchtung Behälter fließen. Vorsichtig mischen und die Blutplättchen Amotosalen Gemischs und exprimieren die Luft aus dem Behälter in die Ausleuchtung Amotosalen Behälters. Ausdrücken eine kleine Menge der Blutplättchen Mischung in den Schlauch, Füllen etwa 4 cm von den Schläuchen. Dadurch wird sichergestellt, Thrombozyten sowohl in der Schlauch-und Beleuchtungs-Behälter durchlaufen den Erreger inactivatiauf die Behandlung. Verschließen Sie den Schlauch zwischen der Beleuchtung Behälter und Amotosalen Behälter. Hinterlegen nicht mehr als etwa 4 cm von Schläuchen, die sich von der Beleuchtungsvorrichtung Behälters. Entfernen und entsorgen Sie die leere Blutplättchen und Amotosalen Behälter und schließen Sie die Klemmen auf die Probenahme Beutel. Platzieren Sie die Verarbeitungssatz in den Illuminator mit dem Beleuchtungssystem Behälters in dem großen Fach auf der linken und der Organisator in der kleineren Kammer auf der rechten Seite. Mit dem Hand-held Barcode-Gerät, um die Spende ID, Produkt-Code und-verarbeitung Satz Losnummer in den Illuminator geben. Schließen Sie die Metallabdeckung und wenn sie auf dem Illuminator grafische Benutzeroberfläche aufgefordert, schließen Sie die Schublade. Drücken Sie auf "Start", um die Beleuchtung zu starten. Nach der Belichtung, entfernen Sie die Verarbeitung Satz von der Beleuchtungseinrichtung. Der Illuminator druckt automatisch die Behandlung Bericht für die behandelten Thrombozyten Einheit (en). Packen Sie die Behälter von dem Veranstalter und hängen Sie die platelets und Verarbeitungssatzes, brechen die Kanüle an dem Auslass des Beleuchtungssystems Behälters und damit die Thrombozyten in die Verbindung Adsorptionsvorrichtung (CAD) Behälter fließen. Dabei nicht um den CAD Wafer biegen, exprimieren die Luft aus dem Behälter in den CAD Ausleuchtung Behälter unter Verwendung eines Plasma-Extraktor. Abzudichten den Schlauch in der Nähe der Einlaßöffnung des Behälters CAD. Entfernen und entsorgen Sie die leere Beleuchtung Behälter. Legen Sie die CAD-Container mit den Attached Storage Container auf einem Plättchen Rührwerk für mindestens 6 h, aber nicht mehr als 16 Stunden. Dies wird im Abbau der Rest Amotosalen auf eine Konzentration von ≤ 2 uM führen. Nach CAD Behandlung, entfernen Sie die Thrombozyten-Einheiten aus dem Rührwerk. Hängen Sie die Blutplättchen. Brechen die Kanüle und damit Blutplättchen, um in die Lagerbehälter fließen kann. Exprimieren die Luft aus den Vorratsbehältern in den CAD-Container. Das verbliebene Plättchenkonzentrat fließen wieder in den Vorratsbehältern durchSchwerkraft. Verschließen Sie den Schlauch über dem Y-Stück und die leere CAD Behälter. Umzuverteilen das Volumen zwischen den Vorratsbehältern nach Bedarf. Lautstärkeeinstellungen werden durch Wägung der Vorratsbehälter gemacht. Dichten den Schlauch an jedem Vorratsbehälter wenige Zentimeter über dem Einlass des Vorratsbehälters, dies erleichtert den Erhalt einer sterilen Probe aus dem Endprodukt, wie in 5.2 beschrieben. 5. Produkt-Sampling Für Routine-QC-Tests können die Endlagerung Containern nach den Probenahme-Beutel auf den Vorratsbehältern abgetastet werden. Um dies zu tun, sicherzustellen, dass die Blutplättchen Gerät ist gut gemischt, dann öffnen Sie die Klemme an dem Beutel und drücken Sie mehrere Male. Verschließen Sie den Schlauch nach der Beutel mit Thrombozyten gefüllt. Übertragen Sie die Thrombozyten Probe in einem geeigneten Labor Rohr und führen Tests sofort. Um Proben zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten im Laufe der Lagerung, wie etwa für eine Validierungsstudie, sterile Verbindungein neuer Probenbehälter auf das Rohr des Plättchens Vorratsbehälter. Sicherstellen, dass die Blutplättchen sind gut vor dem Probenbehälter übertragen gemischt. 6. In vitro Funktion Auswertung Aus diesem Validierungsstudie wurde in vitro Evaluierung nach CAD-Behandlung (Tag 1 oder Tag 2, je nach CAD Dauer) und erneut am Tag 4 durchgeführt (oder Tag 5) und Tag 7. In-vitro-Messungen enthalten Volumen, Thrombozytenzahl, pH, Blutgasanalyse (pO 2, pCO 2), Glukose, Laktat und Schwenken. Das Volumen wurde mit 1,01 Gew. g / ml auf der spezifischen Dichte von Blutplättchen in Additiv-Lösung bestimmt. Hämoglobin Kontamination wurde visuell mit Vergleich zu einer Farbkarte ausgewertet. Swirling wurde visuell bestimmt. Siehe "Tabelle der Ausrüstung" für Methodik der anderen Assays. 7. Repräsentative Ergebnisse Das Verfahren zur Herstellung double Dosis Leukozytenfilm Plättchen beginnt mit der Produktion von individuellen Buffy Coats, die Zielvorgaben zu erfüllen für Volumen-und Hämatokrit. Da es nicht sinnvoll, den Hämatokrit des einzelnen Buffy Coats während der letzten Prozessvalidierung zu messen, haben wir begonnen, indem sie sich verpflichten eine separate bemüht, unsere Buffy Coats zu optimieren, um sicherzustellen, könnten wir konsequent erfüllen Zielvolumen und Hämatokrit. Wie in Tabelle 1 gezeigt, der optimierten buffy coats positiv auf die Zielwerte für die Menge und den Hämatokrit bei 46 ± 2 ml und 37 ± 3%, jeweils verglichen. Nach Bündelung, sollte die Menge und Hämatokrit des Leukozytenmanschette Pool etwa 600 ml und 20% liegen, jeweils vor dem weichen Spin Zentrifugation. Wie in Tabelle 2 dargestellt, gemittelt unserer Leukozytenmanschette Pools 615 ± 5 ml; der Hämatokrit durchschnittlich 19 ± 1%. Die weichen spin Ergebnisse in einer doppelten Dosis Thrombozyten concentrate, dass der Eingang für Pathogeninaktivierung Nutzung des INTERCEPT Blood System DS Verarbeitungssatzes gerecht wird. Key Eingabeparameter für INTERCEPT Behandlung gehören Lautstärke, Thrombozytenzahl, Plasma-Verhältnis und RBC Inhalt. Darüber hinaus streben wir an, ≥ 75% der Thrombozyten im Thrombozytenkonzentrat erholen, wie der Buffy-Coat-Pool verglichen. Per lokalen Anforderungen, muss der weißen Blutkörperchen (WBC) Verschmutzung <1×10 6 / Einheit. Die Thrombozytenkonzentrate in unserem Validierung erfüllt die wichtigsten Parameter für INTERCEPT Behandlung sowie die Ziele für WBC Verschmutzung und Plättchenregenerationsrate wie in Tabelle 3 dargestellt. Das INTERCEPT Verfahren zur Pathogeninaktivierung basiert auf der doppelten Dosis Thrombozytenkonzentrat mit einer einzigen INTERCEPT Verarbeitungssatzes durchgeführt. Die Verarbeitung enthält zwei integralen Vorratsbehälter, die der behandelten Einheit in zwei einzelne therapeutische Dosen Blutplättchen bei Beendigung des Weges aufgeteilt werden könnenogen Inaktivierung. Europäische Richtlinien verlangen, dass 75% der getesteten Einheiten ≥ 200×10 9 Blutplättchen enthalten pro therapeutischen Dose1; lokalen Anforderungen in Schweden verlangen, dass 75% der Anteile geprüft> enthalten 240×10 9 Thrombozyten pro Dosis. Nach INTERCEPT Behandlung betrug die durchschnittliche Thrombozytengehalt 265 ± 22 x 10 9 (n = 24). Außerdem trafen 88% der Anteile oder überschritten 240×10 9 Thrombozyten pro therapeutischen Dosis, dies ist auch im Rahmen der beiden europäischen Richtlinien und schwedischen Vorschriften. Siehe Abb. 1 & 2 für eine Darstellung der doppelte Dosis Leukozytenfilm Vorbereitung und INTERCEPT Behandlungsverfahren sind. Aus diesem Validierung, maßen wir die in vitro-Eigenschaften der Thrombozytenkonzentrate nach INTERCEPT Behandlung (dh nach der Trennung in die einzelnen Vorratsbehältern); Parameter wurden über 7 Tagen Lagerung gemessen. Mittelwert und Standardabweichung wurden gesammeltBlutplättchen-Dosis, pH, pO 2, pCO 2, Lactat und Glucose Produktion Verbrauch. Abbildung 3 zeigt die mittlere beginnend Blutplättchen Dosis der doppelten Dosis Plättchenkonzentrat vor INTERCEPT Behandlung und dem mittleren Plättchen-Dosis in jeder der Spaltprodukte nach der Behandlung über INTERCEPT 7 Tagen Lagerung. Platelet Verlust während der Lagerung betrug etwa 9%. Diese Reduktion ist nicht verschieden von den erwarteten Verlust von Thrombozyten während der Lagerung von konventionellen Thrombozyten. 2 Tabelle 4 fasst die in vitro Eigenschaften der INTERCEPT Blutplättchen nach der Behandlung und Aufteilen in einzelne Einheiten. Per europäischen Anforderungen, muss der pH-Wert der Blutplättchen über 6,4 bis zum Ende der Haltbarkeitsdauer bleiben. Während der Verarbeitung, Konzentrate der pH der Thrombozyten fällt leicht auf der Blutplättchenkonzentration, Volumen und die Gasdurchlässigkeit der Blutplättchen basiert stoWut Behälters. 4 stellt den pH-Wert der geteilten Thrombozytenprodukten über 7 Tagen Lagerung. Während der Lagerung, ist der pH-Wert stabil und gut innerhalb der Verarbeitungsanforderungen aufrechterhalten. Wie in 5A und 5B, der Thrombozyten-O 2-Verbrauch und die CO 2-Produktion zeigen an, setzte die Atmung durch die INTERCEPT Blutplättchen im PL2410 Behälter während 7 Tagen Lagerung. 6A und 6B zeigen die Laktat und Glukose über 7 Tagen Lagerung . Blutplättchen-Glucose und Lactatproduktion stimmen miteinander während der 7-tägiger Lagerung. 5 Einheiten hatten Glukosespiegel weniger als 1,11 mmol / l (die Untergrenze für das Glucose-Assay). Der Buffy-Coat-Zubereitung und Bündelung Validierung produziert Thrombozytenkonzentrate, dass trafen die Eingangs-Kriterien für INTERCEPT Behandlung; speziell, Volumen, Thrombozytenzahl, Plasma-Verhältnis und rot blood Zellkontamination. Die letzten Einheiten erfüllt die Prüfkriterien über 7 Tage der Lagerung einschließlich Thrombozyten Dosis und pH-Wert. Parameter Target Range Ergebnisse Mittelwert ± SD Volumen (ml) ~ 48 46 ± 2 Hämatokrit (%) ~ 37 37 ± 3 Halten Sie Zeit vor Pooling Übernachtung auf Rührwerk Übernachtung auf Rührwerk Tabelle 1. Merkmale der einzelnen Buffy Coats (n = 19). Parameter Target Range Ergebnisse Mittelwert ± SD Volumen (ml) ~ 600 615 ± 5 Hematocrit (%) ~ 20 19 ± 1 Haltezeit vor der Zentrifugation 1 h auf Rührwerk 1 h auf Rührwerk Tabelle 2. Merkmale der Buffy Coat Pools (n = 12). Parameter Ziel Ergebnisse Mittelwert ± SD Volumen (ml) 370 bis 420 404 ± 8 Thrombozytenzahl (x10 9 / Einheit) 250 bis 700 577 ± 62 Mittlere Platelet Recovery (%) ≥ 75 75 ± 4 Plasma-Ratio (%) 32 bis 47 38 ± 1 RBC (x10 6 / ml) ≤ 4 1,2 ± 0,4 WBC (x10 6 </sup> / Einheit) ≤ 1 0,11 ± 0,1 Halten Sie Zeit vor INTERCEPT (hr) ≤ Ende von Tag 1 ≤ Ende von Tag 1 Tabelle 3. Merkmale des Double-Dose Thrombozytenkonzentraten (n = 12). Mittelwert ± Standardabweichung Min Max Volumen (ml) 199 ± 16 182 236 Thrombozytenzahl (x10 9 / Einheit) 265 ± 22 225 292 pH (22 ° C) 6,9 ± 0,1 6,8 7,0 pO 2 (kPa) 21,4 ± 4,8 12,8 27,3 pCO 2 (kPa) 4,3 & plusmn; 0,4 3,3 4,9 Lactat (mmol / l) 9,1 ± 1,7 6,8 12,4 Glucose (mmol / l) 5,3 ± 0,9 3,7 6,5 Tabelle 4. Merkmale des INTERCEPT behandelte Thrombozyten Day 1/2 (Einzel-Units, n = 24). Abbildung 1. Herstellung einer doppelten Dosis Thrombozytenkonzentrat aus einem Pool von 7 buffy coats. Abbildung 2. Pathogeninaktivierung einer doppelten Dosis Thrombozytenkonzentrat mit dem INTERCEPT Blood System. Abbildung 3. Mittlere Blutplättchen Dosis vor und für7 Tage nach INTERCEPT-Behandlung (n = 12 vor INTERCEPT; n = 24 nach INTERCEPT). Abbildung 4. Mittelwert ± SD pH Blutplättchen nach INTERCEPT Behandlung (n = 24). 5A. Mittelwert ± SD pO 2 nach INTERCEPT Behandlung (n = 24). 5B. Mittlere pO 2 ± SD nach INTERCEPT-Behandlung (n = 24). 6A. Mittlere Laktatwerte ± SD nach INTERCEPT-Behandlung (n = 24). 6B. Mittlere Blutzuckerwerte &plusmn; SD nach INTERCEPT-Behandlung (n = 24).