אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T<em> In vivo</em> באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.
מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים 1-4.
אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי 5-MHC עצמי.
סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים 6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes 7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype 10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.
הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלב…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לינג ג'אנג לסיוע הטכני שלו. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-86595). TAB הוא ניו חוקר ומלומד CIHR AHFMR. QH נתמך על ידי מלגת CIHR קנדה למוסמכים – דוקטורנטים וStudentship AIHS במשרה מלאה. SAN נתמך על ידי מלגת מלכת אליזבת השנייה בוגר. AYWS נתמך על ידי מלגות לתארים מתקדמים NSERC – דוקטורט.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |