L'examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux
Summary
Nous présentons une cytométrie de flux basé sur la méthode pour examiner le développement des cellules T<em> In vivo</em> En utilisant des souris génétiquement manipulées sur un fond de type sauvage ou récepteur des cellules T transgéniques.
Abstract
Un système immunitaire sain nécessite que les cellules T répondent aux antigènes étrangers tout en restant tolérant aux antigènes du soi. Réarrangement aléatoire du récepteur des cellules T (TCR) α et β loci génère un répertoire de lymphocytes T avec la grande diversité dans la spécificité d'antigènes, à la fois pour soi et étranger. Sélection du répertoire au cours du développement dans le thymus est essentiel pour générer sûrs et utiles lymphocytes T. Les défauts de la sélection thymique contribuer au développement de maladies auto-immunes et de l'immunodéficience 1-4.
Progéniteurs des cellules T entrez le thymus que double négatifs (DN) thymocytes qui n'expriment pas CD4 ou CD8 co-récepteurs. L'expression de la αβTCR et les deux co-récepteurs se produit à la double positif (DP) scène. L'interaction de la αβTCR avec l'auto-peptide-CMH (pMHC) présenté par les cellules thymiques détermine le sort de la thymocytes DP. Interactions de haute affinité conduire à une sélection négative et éliminationtion des matières autoréactives thymocytes. Faible affinité des interactions se traduisent par une sélection positive et le développement de CD4 ou CD8 simples positives (SP) des lymphocytes T capables de reconnaître des antigènes étrangers présentés par CMH du soi 5.
La sélection positive peut être étudiée chez la souris avec un anticorps polyclonal (type sauvage) répertoire de TCR en observant la génération de cellules T matures. Cependant, ils ne sont pas idéales pour l'étude de la sélection négative, ce qui implique la suppression de petites populations spécifiques de l'antigène. De nombreux systèmes modèles ont été utilisés pour étudier la sélection négative, mais varient dans leur capacité de récapituler les événements physiologiques 6. Par exemple, la stimulation in vitro des thymocytes manque de l'environnement thymique qui est intimement impliqué dans la sélection, tandis que l'administration de l'antigène exogène peut conduire à la non-spécifique suppression des thymocytes 7-9. À l'heure actuelle, les meilleurs outils pour l'étude de la sélection négative vivo sont des souris qui expriment une transgenic TCR spécifique pour endogène auto-antigène. Toutefois, de nombreux modèles classiques TCR transgéniques sont caractérisées par prématurée expression transgénique de la chaîne TCRα au stade DN, entraînant prématuré de sélection négative. Notre laboratoire a mis au point le modèle HY cd4, dans lequel le transgénique HY TCRα est conditionnellement exprimé au stade DP, permettant la sélection négative se produire lors de la DP à la transition SP comme c'est le cas chez les souris de type sauvage 10.
Ici, nous décrivons une cytométrie de flux à base de protocole pour examiner thymique sélection positive et négative dans le modèle HY souris CD4. Bien que la sélection négative chez la souris cd4 HY est très physiologique, ces méthodes peuvent également être appliquées à d'autres modèles transgéniques TCR. Nous présenterons également les stratégies générales pour l'analyse de la sélection positive dans un répertoire polyclonal applicable à toutes les souris manipulées génétiquement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici peut être utilisé pour examiner sélection positive et négative dans le non-TCR transgénique et TCR des souris transgéniques. Ce protocole décrit la coloration des antigènes de surface. Pour une analyse plus approfondie des mécanismes moléculaires, il est souvent nécessaire d'effectuer une coloration intracellulaire. Nous utilisons la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit pour la plupart des protéines intracellulaires et le kit de BD Biosciences coloration pour des facteurs de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Bing Zhang pour son aide technique. Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé (MOP-86595). TAB est un nouveau chercheur des IRSC et chercheur AHFMR. QH est soutenu par une bourse d'études supérieures du Canada des IRSC – Doctorat et une AIHS à temps plein bourse. SAN est soutenu par une bourse de la Reine Elizabeth II d'études supérieures. AYWS est soutenu par une bourse d'études supérieures du CRSNG – Doctorat.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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