Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso
Summary
Vi presentiamo un metodo basato citometria di flusso per esaminare lo sviluppo delle cellule T<em> In vivo</em> Utilizzando topi geneticamente manipolati su un tipo selvatico o T sfondo recettore delle cellule transgeniche.
Abstract
Un sistema immunitario sano è necessario che le cellule T rispondono agli antigeni estranei, pur rimanendo tolleranza di auto-antigeni. Riarrangiamento casuale del recettore delle cellule T (TCR) α e β loci genera un repertorio T cella con grande diversità nella specificità antigenica, sia per sé ed esteri. Selezione del repertorio durante lo sviluppo nel timo è critica per generare le cellule T sicuro e utile. Difetti di selezione timica contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni e immunodeficienza 1-4.
Progenitori delle cellule T inserire il timo come doppi negativi (DN) timociti che non esprimono CD4 o CD8 co-recettori. Espressione del αβTCR ed entrambi co-recettori avviene a doppio positivo (DP) stadio. Interazione del αβTCR con auto-peptide-MHC (pMHC) presentata da parte delle cellule del timo determina il destino del timociti DP. Interazioni ad alta affinità portare alla selezione negativa e di eliminazionezione di auto-reattivi timociti. Bassa affinità risultato interazioni in selezione positiva e sviluppo di CD4 o CD8 singoli positivi (SP) cellule T capaci di riconoscere antigeni estranei presentati da auto-MHC 5.
Selezione positiva può essere studiata in topi con un anticorpo (tipo selvatico) repertorio TCR osservando la generazione di cellule T mature. Tuttavia, essi non sono ideali per lo studio di selezione negativa, che comporta l'eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni. Molti sistemi modello sono stati utilizzati per studiare selezione negativa, ma variano nella loro capacità di ricapitolare eventi fisiologici 6. Per esempio, stimolazione in vitro dei timociti manca dell'ambiente timica che è intimamente coinvolto nella selezione, mentre la somministrazione di antigene esogeno può portare a non-specifico delezione di timociti 7-9. Attualmente, i migliori strumenti per lo studio in vivo selezione negativa sono topi che esprimono una transgENIC specifico TCR per endogena auto-antigene. Tuttavia, molti classici modelli transgenici TCR sono caratterizzati dalla prematura espressione della catena transgenico TCRα nella fase DN, con conseguente prematuro selezione negativa. Il nostro laboratorio ha sviluppato il modello HY cd4, in cui il transgenico HY TCRα condizionatamente espressa nella fase DP, consentendo la selezione negativa a verificarsi durante il DP di transizione SP come avviene nei topi di tipo selvatico 10.
Qui, si descrive un protocollo basato citometria di flusso per esaminare timica selezione positiva e negativa nel topo HY modello CD4. Mentre la selezione negativa in topi CD4 HY è altamente fisiologica, questi metodi possono essere applicati anche ad altri modelli transgenici TCR. Ci sarà anche la presentazione delle strategie generali per l'analisi di selezione positiva in un repertorio policlonale applicabile a tutti i topi geneticamente manipolati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per esaminare selezione positiva e negativa in non-transgenici TCR e TCR topi transgenici. Questo protocollo descrive la colorazione degli antigeni di superficie. Per un'ulteriore analisi dei meccanismi molecolari, è spesso necessario eseguire la colorazione intracellulare. Usiamo il BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit per la maggior parte delle proteine intracellulari e la Foxp3 BD Biosciences Kit di colorazione per fattori di trascrizione. Noi di solito …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Bing Zhang per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB è un investigatore CIHR Nuovo e Scholar AHFMR. QH è sostenuto da una borsa di studio CIHR Canada Graduate – Dottorato e un AIHS tempo pieno Studentship. SAN è sostenuto da una borsa di studio Queen Elizabeth II Graduate. AYWS è sostenuto da una borsa di studio post-laurea NSERC – Dottorato.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
