Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Moleküler Biyoloji 1. Tasarım Construct Protein yapı ve kodon tasarlanmış sentetik gen dizileri tasarım Gen Composer yazılımı kullanın. Gen Besteci yazılım kullanımı başka bir yerde 3 detaylı olarak sunulmuştur. Hizalama Görüntüleyici Modülü kullanın ve protein dizi hizalamalarını karşılaştırmak ve protein yapı tanımlamak için Tasarım Modülü oluşturun. , Varsa (Şekil 2) Protein Data Bank (PDB) içinde homologları, birincil ve 3D yapı elemanları hem de bir hedef amino asit dizisi hizalama. Birincil yapısının korunması ve homologları 3D yapıları dayalı yeni Termini seçerek yapısı güdümlü yapı tasarımlar yapmak için hizalama bilgileri kullanın. Tasarım eklemek PCR (IPCR) ve vektör PCR (vPCR) amplimers (Terminal astar). Gen C kullanarakomposer protein-to-DNA algoritması kodon tasarlanmış bir nükleik asit dizisi içinde, yapının amino asit dizisini geri çevirmek. E. ifade için sırasını optimize etmek için uygun kodon kullanım tablosu (CUT) kullanın coli. Hemen hemen kolayca saflaştırılmasını sağlar bunun bir N-terminali 6x histidin takısı ve Smt3/SUMO füzyon proteini dahil etmek üzere modifiye pET28 vektörü içine uç klonu. DNA 2.0 ve Entegre DNA Technologies için astar ile sentetik gen siparişinizi verin. 2. Polimeraz Eksik Primer Uzatma (BORU) Klon Astarlar ve Genler hazırlayın 1 dakika 1.000 rpm'de astar içeren satıcı tarafından sağlanan plakaları santrifüj. Astar konsantrasyonu 100 mcM getirin ve 50 ul TE tampon ekleyin. Bir 96-bölmeli V-dipli bir levha üzerinde deiyonize (Dİ) su ile 10 uM primerler ile seyreltilir. 1 dakika 1.300 rpm'de 1.5 ml tüp satıcı tarafından sağlanan gen santrifüj. <li> TE tamponu kullanarak, 50 ng / ml, her tüp DNA konsantrasyonu getirir. 1.5 ml tüpler içinde, her bir primer seyreltileri 10 ng / ul yapmak. Kullanılmadığı zaman -20 ° C'de saklayın astar ve genler. Ekle PCR (IPCR) hazırlayın Buz üzerinde Pfu Master Mix bir şişe çözülme; oda sıcaklığında genler ve astar tutun. Astar bir dizi bir tabak haritası atama kuyu oluşturun ve inşa. Bir 96-PCR plakanın her oyuğuna DI su ile 13 ul ekle. Her bir uçlarına arasında değiştirmek için sağlanması, plaka haritaya göre 96 oyuklu plaka içindeki her bir reaksiyon için ileriye 5 ul ve ters primer 5 ul ekleyin. De plaka haritasına göre kendine uygun her tam uzunlukta gen 2 ul ekleyin. Her iyi arasında ipuçları değiştirmek için sağlanması, her bir kuyunun Pfu ana karışımı 25 ul ekleyin. Aşağıdaki PCR koşulları kullanılarak reaksiyon döngüsü: 95 ° C'de 2 dakika </li> 95 ° C de 30 sn 50 ° C 45 sn 68 ° C 3 dk 4 ° C ∞ 25 döngü için adımları bd tekrarlayın. Yeni 96-PCR plaka her IPCR reaksiyon 10 ul aktarın. Her bir örnek için 6X yük boya 3 ul ekle. Parçacık amplifikasyonu onaylamak için 100-500 baz puan DNA merdiveni yanında 110 V% 1 TAE EtBr agaroz jel üzerinde her örnek ayırın. -20 ° C'de saklayın IPCR ürün kullanılmadığı zaman (donma çözülme mümkün olduğu kadar kaçının). 3. Vektör PCR (vPCR) hazırlayın Dönüşüm E. gecede kültür Başlangıç plazmid pET28 vektörü ile coli. 50 ug / ml kanamisin ile 2-YT brot iki 5 ml tüpler inoküle. 220 devirde 37 gecede kültürler ° çalkalayıcı C büyütün. 15 dakika 3.000 rpm'de santrifüj gece büyüme sonra kültürler aşağı doğru döndürün. QIA, bir Qiagen kullanınhazırlık Spin Miniprep Kit üreticinin talimatlarına göre bakteriyel pelet pET28 vektör ayıklayın. Kurulum sınırlama enzimi sindirim pET28 plazmid ekstre edilmiştir. PET28 vektörü, 20 ul 10X tampon BamHI 2.2 ul ve BamHI ve Hindlll 1 ul ekle. 37 ° C'de 1 saat boyunca reaksiyon inkübe ° C. Bir jel üzerinde ayrı bir sindirim ürünü. 2.2.10 adıma bakın. Vektör bandı jelden kesilmiş ve imalatçının talimatlarına göre QIAquick jel ekstre etme kiti kullanılarak arındırmak. Bir NanoDrop kullanarak, DNA konsantrasyonu ölçmek. 10 ng / ul vektör kesim sulandırmak. -20 ° C kullanılmadığı zaman mağaza. VPCR astar hazırlayın. 1.300 rpm'de 1 dakika IDT verilen oligonucliotides santrifüj. DI su ile 100 uM konsantrasyonda getirin. 1.5 ml tüp hem ileri ve geri primerleri 10 mcM seyreltme hazırlayın. -20 ° C'de saklayın astar ve astar dilüsyonları Oda sıcaklığında buz ve çözülme şablon ve astar üzerinde Pfu Master Mix çözülme. Bir 96-PCR plaka Kurulum vPCR reaksiyonlar: Bir 96-plaka ilk satırda ileri ve geri vPCR astar hem de 60 ul ve sindirilmiş pET28 şablonu (ul / 10 ng) 24 ul birleştirir. 12-ucu çok kanallı pipet kullanarak, her plakanın iyi kalan 12 astar ul ve şablon ana karışımı aktarın. Bu primer ve plaka her bir şablon ana karışımı 12 ul ile sonuçlanmalıdır. Her bir kuyunun DI su 13 ul ekleyin. Her bir kuyunun Pfu Master Mix 25 ul ekleyin. Adım 2.2.7 kullanılan PCR koşulları arasında geçiş reaksiyonlar. Havuz 15 ml Falcon tüp içine vPCR reaksiyonların tüm. (Sindirilmiş pET28 vektörü beklenen uzunluğu bir jel üzerinde toplanmış PCR ürünü, 10 ul ayırarak parçacık amplifikasyonu doğrulamayaklaşık 6 kb) 'dir. 2.2.10 adıma bakın. Plakaları birleştirme hazırlayın. Bir 96-bölmeli V-dipli plakanın her oyuğuna vPCR ürünün kısım 3 ul. -20 Mağaza plakaları ° IPCR ürün ile birleştirme kadar C. 4. IPCR ve vPCR Ürünler Birleştirme Çözülme IPCR ürün ve ön aliquoted vPCR 96-oda sıcaklığında plaka birleştirme. Birleştirme plaka ile ilgili de her IPCR ürünün 3 ul ekleyin. Top Ten kimyasal yetkili hücrelerine plaka birleştirme Transform. Satıcı tarafından sağlanan kimyasal yetkili bir hücre tek 50 ul tüpüne her birleştirme reaksiyon 2 ul ekleyin ve üreticinin verilen protokol ile devam edin. Dönüşüm plağı üzerindeki her bir yapı için bir gecede kültür hazırlayın. Derin bir kuyudan bloğun her kuyuya, 25 ml'lik steril bir hazneden kısım 5 mL TB suyu (50 ug / ml kanamisin ile birlikte). Steri kullanarakle tekniği, her dönüşüm plaka bir izole edilmiş bir koloni almak ve derin kuyu bloğunun uygun iyi aşılamak. Bir AIRPORE kapaklı blok örtün. 37 ° C de bir gece boyunca 220 rpm'de blok çalkalayın. 4,000 rpm'de 30 dakika boyunca santrifüj ile pelet blok hücreleri. Süpernatantı dökün ve bir kağıt havluyla blok üst pat. Mini hazırlık üreticinin talimatlarına göre bir Qiagen 96 oyuklu vakum aygıtı kullanılarak. 5. Başarıyla Klonlanmış Yapılar bir Gliserin Hisse Senedi hazırlanması Başarılı bir şekilde, üretici talimatlarına göre BL21 (DE3) 'kimyasal olarak yeterli hücrelerini içerisine klonlanmış DNA sekansı doğrulanır dönüşümü. Her bir yapı için, 2-YT brot 1 ml (50 ug / ml kanamisin ile) içine BL21 (DE3) dönüştürme ve inokülasyon tek izole edilen bir koloninin al. 37 3-4 saat 220 rpm'de kültürler sallamak ° C 1.5 ml etiketeşsiz yapı kimlik numarası, cep gerginlik ve tarih ile kap tüp vida. % 50 gliserol, 500 ul ve hücre kültür, 500 ul ekle ve birkaç kez ters çevirin. Hemen kuru buz veya -80 ° C derin dondurucuda gliserol stok saklayın. 6. İfade Test Lizis Buffe r Yıkama tamponu Seyreltme Tampon , 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 ' 300 mM NaCI 10 mM imidazol % 1 Tween 20 2 mM MgCl2 0.1 ml / ml Benzonase 1 mg / ml lizozim , 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 ' 300 mM NaCI 20 mM imidazol % 0.05 Tween 20 25 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCI 250 mM imidazol % 0.05 Tween 20 * Ekle Benzonase, lizozim,hemen önce parçalama ve proteaz inhibitörü kullanılmasını içerir. Çizgi bir kanamisin seçici agara gliserol stoktan örnek ve 37 gece boyunca inkübe ° C Bir taze yetiştirilen E ile% 0.5 glukoz ile desteklenmiş 1.2 mi inoküle TBC suyu (50 mg / ml kanamisin ile birlikte), bir 96 oyuklu tabanı yuvarlak bir blok olmayan bir indükleyici ön-kültürün Başlangıç coli izole. Gece 37 ° C'de 220 rpm'de sallayarak büyümek Gece boyunca büyüme sonrası, Novagen Gecelik Hızlı Sistem 1 (üreticinin protokolüne göre) ön-kültürün 40 ul ile takviye TBC suyu, 1,2 ml (50 mg / ml kanamisin ile) inoküle indüksiyon kültürleri başlar. 220 rpm sallayarak, 48 saat 20 ° C de küçük ölçekli indüksiyon kültürler büyütün. 15 dakika için 4000 rpm'de santrifüj Hasat hücreleri, önceden işlem için en az 1 saat boyunca -20 ° C'de süpernatan ve mağaza ° C dökün. 96 oyuklu bloğunda, 300 ul lizis tamponu içinde tekrar süspansiyon hücre topakları. </li> Kuvvetli bir şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak mekanik lizisi ve ardından 30 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis tamponu içinde inkübe hücreleri. 4 ° C'de 4,000 rpm'de 30 dakika için santrifüjleme ile ham lizat açıklamak Bir 96-gözenekli düz tabanlı tepsi (Qiagen) ile açıklık lizat (çözünebilir fraksiyon) 200 ul transfer etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Iyi bir örneği içeren her biri için, 40 ul birleştirilen Ni-NTA manyetik boncuk (Qiagen) ekleyin. Yavaşça 16 ° C de 1 saat boyunca bir rocker plaka ajitasyon Bir manyetik sonrası plakası (Qiagen) üzerinde plaka yerleştirin ve ilişkisiz çözünür fraksiyon çıkarın. Ni-NTA boncuk herhangi birini pipetle değil dikkat edin. Sonrası plaka plaka çıkarın ve yavaşça 200 ul yıkama tamponu ile boncuk yeniden süspansiyona alınmıştır. Pipet ve aşağı yukarı 30 saniye sonra sonrası plaka geri plaka yerleştirin. Yıkama tamponu çıkarın ve adım 6.12 tekrarlayın. Yazılan plaka plaka çıkarın ve Ni-NTA ta bağlı Zehir5 dakika boyunca 50 ul yıkama tamponu ile yıkanarak rget proteini. Manyetik sonrası plakasına düz tabanlı plaka dönmek ve yeni bir 96-bölmeli V-dipli plaka elüsyon aktarın. Yeni bir 96-bölmeli V-dipli plakasına elüsyonun 20 ul aktarın ve 1 ul ULP1 proteaz ile reaksiyona girerler. Üreticinin protokole göre, bir LabChip 90 kullanarak kılcal elektroforez ile yıkandı ve yıkandı + Ulp1 kısmını analiz. Alternatif olarak, ifade test tüm fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edilebilir. 7. Büyük Ölçekli Fermantasyon Bir gliserol stoktan bir sıyrık elde etmek için steril bir pipet kullanın, 100 ml TB suyu (50 mg / ml kanamisin ile) aşılamak ve gece büyür. 220 rpm ve 37 ° C de sallamak Gece boyunca büyüme sonrası, 10 ml 2 L'lik bir şişe içerisinde şaşkın Merck autoinduction çözümleri (üreticinin protokolü bakınız), (50 mg / ml kanamisin ile) TBC suyu 1 L aşılayarak ön-kültürün genişletmekön-kültürün (1:100 seyreltme). 37 genişletilmiş 1 L kültürler çalkalayın ° C; 20 sallayarak inkübatör sıcaklığı değiştirmek ° C 0,6 (OD 600) bir optik yoğunluk ulaşıldığında. Gece büyüme sonra, ifade test için her yapı bir temsilci 10 ml kısım almak. Hasat hücre 15 dakika için 5000 rpm'de santrifüjleme ile yapıştırma ve supernatant atın. -80 Yapıştırın Freeze hücre ° C PROTEİN ARITMA Tamponlar: Lizis Tampon A (Dengeleme) Tampon Tampon B (elüsyon) Sütun Tampon boyutlandırma 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI % 0.5 gliserol % 0.02 CHAPS 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 5 ul Benzonase 100 mg Lizozim 3 Proteaz İnhibitör Tablet (EDTA-ücretsiz) 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin % 0.25 gliserol 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI 200 mM imidazol 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCI % 1 gliserol 1 mM TCEP * Hemen lizis önce her 150 ml'lik bir numune için Benzonase, lizozim ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin. 8. Hücre Lizis Lizis tamponu, 2 L yapmak, lizozim, proteaz inhibitörü tablet ya da Benzonase (her bir numune lizis tamponu 150 ml ayrı lize edilecektir) ekleyin. Çözülme ve tekrar süspansiyon hücre 1:5 kitlesel lizis tamponu içinde yapıştırın: hacim oranında kuvvetli bir şekilde 4, 30 dakika boyunca karıştırma ° C. Temiz bir spatula ile beher taraftan gevşek parçalar kırın. Bu dönemde Ni ve Dialy hazırlamaksis Tamponlar Buz üzerinde, bir Misonix sonikatör (3 dakika 70% güç, 2 saniye / 1 sn kapalı bakliyat) ve aşırı ısınmayı önlemek için yavaşça girdap konteyner kullanarak hücrelerin lyse. Gelecek analizi için ham lizat küçük (200 ul) kısım kaydedin. , 4 35 dakika boyunca 18,000 x g'de santrifüj ile ham lizat ° C açıklamak süpernatan toplamak ve gelecekteki analiz için bir küçük (200 ul) kısım kaydedin. Mağaza pelet 4 ° C de, proteinin çözünür fraksiyonu içine lize edilmiştir teyit kadar. 9. Ön tarafından işletilen Protein Maker Kurulum Protein yapımcısı açık ve yazılım açıkken, araç başlatmak. Bir kez başlatılır, örneklerin her biri için portal ayrı bir satırda bir 5.0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikel-şelat sütun (Ni sütun) ekleyin. Her bir sütun üzerinden dengeleme tamponu 3-4 kolon hacmi (CV) çalıştırın. Dengeleme ve elüsyon tampon hatları hazırlamak. Equilibrbir kez tampon A kolonu boyunca aspire edilerek sütun yedi. 10. Nikel 1 (NI1) Kolon Depolama tamponu çıkarmak için 20 ml Milli-Q su ile her bir sütun yıkayın. 5 ml tampon B ve dengeleme boyunca 25 ml tampon maddesi A çalıştırın. 2 ml / dakika arasında bir oranda sütunlar halinde çözünür protein ihtiva açıklık lizat yük, daha sonra tampon A ile birlikte, 15 ml yıkama takip Tamponlara sahip bir basamaklı bir derece olarak bağlı protein elute saygılı aşağıdaki oranlara göre A ve B: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Ayrı ayrı her elüsyon fraksiyonu toplamak. Analiz: SDS-PAGE ile yıkandı, kesirler, ham lizat, açıklık lizat ve akış yoluyla. Havuz fraksiyonları da protein ihtiva eden ve yaklaşık olarak mevcut olan protein miktarını belirlemek için bir 280 ölçmek için Nanodrop kullanın. 11. ULP1 Dilinim Sonraki jel analizi için NI1 sütun havuz küçük bir kısım (250 ul) tutun. Geri kalanı getir10 ml ve His-Smt çekim etiketi kaldırmak için toplam protein 1 ul / 5 mg ubikuitin benzeri proteaz 1 (ULP1) eklemek için NI1 havuzu. 4 ° C de bir karıştırma plakası üzerinde 10 kDa'lık bir molekül ağırlığı kesme (MWCO) içinde 4 ° C'de 4 saat boyunca tampon A 2 L karşı NI1 havuzu + ULP1 Dialyze Diyaliz sonrası NI1 havuzu ve NI1 havuzu + ULP1 ULP1 bölünme başarılı olup olmadığını belirlemek için SDS-PAGE çalıştırın. 12. Nikel 2 (Ni2) Kolon Aynı Ni kolonundan yarılan protein yükü ve 1 ml / dak 'lık bir düşük akış hızında adım 9.3 tekrarlayın. Bölünmüş kapalı etiketi sütuna bağlamak ve etiketsiz hedef protein şimdi akış-ile olacaktır. Yeni bir kapta flow-through toplayın. 3 ml tamponu ile Ni sütun yıkayın A O'nun tüm etiketli ve spesifik olmayan bağlı protein Zehir için tampon B 5 ml izledi. Ayrı ayrı fraksiyonu toplayın. Ni2 SDS-PAGE yıkama, içinden akan ve Ni2 elüsyon kesirler ULP1 bölünme doğrulamak için ve çalıştırmak protein akış yoluyla mevcuttur. Kabaca proteinin varlığını belirlemek için bir 280 ölçmek için Nanodrop kullanın. 13. Konsantre Ni2 akış yoluyla konsantre (ve protein varsa Ni2 elüsyon) bir Amicon Ultra 10 kDa MWCO santrifüj tüpü ile 5 ml. 4 ° C'de 4000 rpm'de 10 dakika aralıklarla Spin Zar boyunca aşırı konsantre protein önlemek için her spin arasında bir pipet ile karıştırın. 14. Boyut-dışlama Kromatografi (SEC) 0.5 ml / bir AKTApurifier sistemi (GE Healthcare) üzerinde dak 'lık bir akış hızında 200 ml SEC tamponu ile dengeye bir Sephacryl S-100, 10/30 GL sütunu (GE Healthcare) ayarlayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak SEC kolonu üzerinde kullanım için 10 ml superloops hazırlayın. 5 ml şırınga kullanarak, superloops üzerine örnekler yüklemek ve SEC çalışma başlar. Küçük hacimli fr toplarken, 280 nm'de UV emilimi iz Monitöreylemler. SDS-PAGE ile SEC kesirler çalıştırın. En yüksek yoğunluk bantları gösteren SEC kesirler havuzda. Toplanmış SEC kesirler konsantre. 13.1 adıma bakın. 100 ul örnekleri, -80 sıvı azot ve mağaza flaş dondurma ° C içine kısım protein KRİSTALİZASYON 15. Protein Kristalizasyon Tercih kristalizasyonu ekranın 80 ul (Emerald Biyo) ile 96-çukurlu bir kompakt Jr kristalizasyon plakasının her bir rezervuara (Emerald Biyo) önceden doldurmak. 2-20 mg / buz üzerinde ml ve saklamak için tampon boyutlandırma ile protein sulandırmak. 96-kuyu her birine protein ve kristalleşme ekranın 0.4 ul 0.4 ul koyun ve kristal netliğinde sızdırmazlık bandı (Manço) ile kaplayın. 16 plaka Mağaza ° C bir mikroskop altında önümüzdeki birkaç hafta içinde periyodik olarak protein kristalizasyon için kontrol ederken. 16. Kristal Hasat </ P> Ana likör ve etilen glikol bir dondurarak saklama koruyucusu oluşturun. Hedef protein kristal ile de kapsayan açık bant kesin. Boş bir de, karşılık gelen kristalize durumun 1.6 ul ve etilen glikol ve 0.4 ul% 20 etilen glikol ve bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir ve% 80 durum kristalleştirilmesi ile birleştirir. Not: gliserol, yağlar, düşük MW polietilen glikoller ve / veya dondurarak saklama yüzdeleri değişen: kristal kırınım optimize etmek gibi farklı bir dondurarak saklama koruyucuları deneyin. Kapaklı sıvı nitrojen ve kapak dolu bir Dewar bir ALS tarzı disk soğuma hasat önce. Manyetik Kristal Wand (Hampton Research) ve çok iyi çözeltisinden doğrudan kepçe üzerinde kristal büyüklüğüne uygun iç çapa sahip bir CryoLoop yerleştirerek kristal hasat. Hemen c dondurmak flaş ALS tarzı disk içinde kriyoprotektan sonra batığın içine hasat kristal ile CryoLoop daldırmaRystal. Kristallerinin istenen bir dizi için tekrarlayın. 17. Kristal Tarama / Veri Toplama Bir kez hasat ALS disk üzerindeki manyetik cryo disk kapağı yerleştirmek için bir disk değnek kullanmak tamamlandı. Bükülmüş maşa ile, disk ters çevirin. Bir Rigaku AKTÖR Dewar için disk transfer, disk üzerine bir Puck İtici vida ve yukarı bakacak işaretçilerine ile Dewar içinde bırakarak kapağı kapalı yumruk. JDirector yazılımı kullanarak, aşağıdaki parametreleri altında ekran her kristal: 0.5 dereceye ayarlanmış ışın yarık, 50 mm ayarlı dedektör mesafesi, 70 derece görüntü adım, ve maruz kalma süresi 30 saniye olarak ayarlanır. En iyi kristal ve strateji veri toplama için ne olduğunu belirlemek için JDirector çekilen test görüntülerde Mosflm çalıştırın. Mosflm gelen sonuçlara göre tam bir veri kümesi toplayın. 18. Bilgi İşlem / Yapı Tayini Veri kümesi işlemek için XDS / XScale 4 çalıştırın. CCP4 suite yazılımını açın. Kullanılabilir, yüksek homoloji arama modelini kullanarak bir molekül yerine çözüm hesaplamak için Phaser 5 çalıştırın. Bu durumda biz bir arama modeli 6 olarak PDBID 3CW4 kullanılır. Veri kümesi içinde toplanan gözlenen yansıması karşı moleküler modeli geliştirmek için Refmac 7 çalıştırın. Nihai kararı en yüksek kabuk dışına göre ve aşağıdaki parametreleri tarafından belirlenmelidir: R katsayısı>% 50, I / sigma> 2 ve bütünlüğü> 90%. Moleküler grafik yazılımı su tavuğu 8 ile 3 Boyutlu elektron yoğunluğu modeli oluşturmak. PDB içinde yapı yatırma önce yapının kalite doğrulamak için MolProbity 9 yazılımı ile doğrulamak birikimi için uygundur.