Multi-cible approche de traitement parallèle pour Gene à la structure Détermination de la polymérase de l'influenza PB2 Subunit

Un aperçu du protocole est présenté dans la Figure 1. Biologie moléculaire 1. Construire Conception Utilisez un logiciel de compositeur Gene concevoir construction des protéines et des séquences de gènes synthétiques conçus codons. L'utilisation de logiciels de compositeur Gene a été offert en détail ailleurs 3. Utilisez le module de visualisation d'alignement et de construction module de conception de comparer les alignements de séquences de protéines et de définir construction des protéines. Alignez séquence d'acides aminés de la cible à la fois les éléments structurels primaires et 3D à partir des homologues dans la Protein Data Bank (PDB), si disponible (Figure 2). Utiliser les informations d'alignement pour faire des dessins de construct structure guidées en choisissant nouvelles extrémités basé sur la conservation de la structure primaire et des structures 3D des homologues. Conception insert PCR (iPCR) et le vecteur PCR (RVPC) amplimers (borne amorces). Utilisation Gene CL'algorithme de protéine à l'ADN de omposer, arrière-traduire la séquence d'acides aminés de synthèse dans la séquence d'acide nucléique d'ingénierie codon. Utilisez le tableau d'usage des codons bon (CUT) pour optimiser la séquence pour l'expression dans E. coli. Pratiquement cloner insérer dans pET28 vecteur modifié pour intégrer un tag histidine N-terminal 6x et la protéine de fusion Smt3/SUMO qui permet la purification facile. Placez l'ordre des gènes synthétiques avec de l'ADN 2.0 et l'ordre des amorces de Integrated DNA Technologies. 2. Polymerase incomplète Primer Extension (PIPE) Clonage Préparer amorces et les gènes Centrifuger les plaques fournies par le fabricant contenant des amorces à 1000 rpm pendant 1 min. Apportez concentration d'amorce à 100 um et ajouter un tampon TE 50 pi. Diluer amorces à 10 um avec déminéralisée (DI) dans une plaque à fond en V à 96 puits. Centrifuger le gène fourni par le fournisseur dans un tube de 1,5 ml à 1300 rpm pendant 1 min. <li> Utilisation de tampon TE, amener la concentration de l'ADN de chaque tube à 50 ng / pl. Dans des tubes de 1,5 ml, faire des dilutions de chaque amorce à 10 ng / ul. Boutique amorces et des gènes à -20 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé. Préparer Insérer PCR (iPCR) Décongelez un flacon de PFU Master Mix sur la glace; garder les gènes et les amorces à la température ambiante. Créer un plan d'affectation des puits de plaque à un ensemble d'amorces et de construire. Ajouter 13 ul d'eau DI dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits. Ajouter 5 ul de l'avant et 5 pi d'amorce inverse à chaque réaction dans la plaque de 96 puits selon le plan de la plaque, en veillant à changer conseils entre chaque puits. Ajouter 2 ul de chaque gène de pleine longueur à son bien approprié selon le plan de la plaque. Ajouter 25 ul de PFU master mix à chaque puits, en veillant à changer conseils entre chaque puits. Vélo les réactions en utilisant les conditions de PCR suivantes: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 sec 50 ° C 45 sec 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Répétez les étapes bd pour 25 cycles. Transférer 10 pl de chaque réaction iPCR à une nouvelle plaque PCR 96 puits. Ajouter 3 pi de colorant de charge 6X pour chaque échantillon. Séparez chaque échantillon sur un% TAE BET gel d'agarose 1 à 110 V à côté d'un bps échelle d'ADN 100-500 pour confirmer amplification du fragment. Produit en iPCR à -20 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé (éviter un gel dégel autant que possible). 3. Préparer PCR Vector (RVPC) Commencez culture de nuit de transformer E. coli avec pET28 vecteur plasmidique. Inoculer deux tubes de 5 ml de bouillon 2-YT avec 50 pg / ml de kanamycine. Cultivez cultures d'une nuit à 37 ° C dans un shaker à 220 rpm. Isoler les cultures après une nuit de croissance par centrifugation à 3000 rpm pendant 15 min. Utiliser un Qiagen QIAprep Spin Kit Miniprep pour extraire pET28 vecteur de culots bactériens selon les instructions du fabricant. Configuration restriction digestions enzymatiques de pET28 extraits plasmide. Ajouter 2,2 ul de tampon BamHI 10X et 1 pl de BamHI et HindIII à 20 pi de pET28 vecteur. Incuber réaction pendant 1 heure à 37 ° C. Produit de digestion séparés sur un gel. Reportez-vous à l'étape 2.2.10. Couper la bande de vecteur de gel et de purifier à l'aide du kit d'extraction de gel QIAquick selon les instructions du fabricant. L'utilisation d'un NanoDrop, de quantifier la concentration de l'ADN. Diluer couper vecteur à 10 ng / ul. Conserver à -20 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé. Préparer amorces RVPC. Centrifugeuse IDT oligonucliotides fournis pendant 1 min à 1300 rpm. Apportez concentration à 100 microns avec de l'eau DI. Préparer 10 uM dilution des deux amorces sens et antisens dans un tube de 1,5 ml. Boutique amorces et des dilutions d'amorces à -20 ° C. Décongeler Pfu Master Mix sur la glace et dégel matrice et les amorces à la température ambiante. réactions RVPC d'installation dans une plaque PCR 96 puits: Dans la première rangée d'une plaque de 96 puits combinent 60 pl de deux amorces de RVPC avant et arrière et 24 pl d'digéré pET28 gabarit (10 ng / ul). Avec une pipette multicanal 12-tip, transférer 12 pi de l'apprêt et le mélange maître de modèle à rester chaque puits de la plaque. Cela devrait se traduire par 12 pi de l'apprêt et master mix de modèle dans chaque puits de la plaque. Ajouter 13 ul d'eau DI à chaque puits. Ajouter 25 ul de PFU Master Mix dans chaque puits. Vélo les réactions à travers les conditions de PCR utilisées à l'étape 2.2.7. Piscine toutes les réactions RVPC dans un tube Falcon de 15 ml. Vérifiez amplification de fragments en séparant 10 pi de produit de PCR en commun sur un gel (durée prévue du digéré vecteur pET28est d'environ 6 kb). Reportez-vous à l'étape 2.2.10. Préparer fusionner plaques. Aliquote 3 pi de produit RVPC dans chaque puits d'une plaque à fond en V à 96 puits. plaques de conserver à -20 ° C jusqu'à la fusion avec le produit iPCR. 4. Fusionner iPCR et RVPC produits produits IPCR de dégel et pré-aliquotée RVPC 96 puits fusionnent plaque à la température ambiante. Ajouter 3 pi de chaque produit iPCR à son bien respective de la plaque de fusion. Transformez fusionner plaque dans Top Ten des cellules compétentes chimiquement. Ajouter 2 pi de chaque réaction de fusion en un seul tube de 50 pi de cellules chimiquement compétentes fournis par le fabricant et procéder avec le protocole fourni par le fabricant. Préparer cultures d'une nuit pour chaque construction de la plaque de transformation. Aliquote de 5 bouillon de TB ml (avec 50 pg / ml de kanamycine) à partir d'un réservoir stérile ml 25 dans chaque puits d'un bloc de puits profonds. Utiliser Sterile technique, vous obtenez une colonie isolée de chaque plaque de transformation et inoculer le bien approprié du bloc puits profond. Couvrir le bloc avec une couverture AirPore. Secouez bloc à 220 rpm à 37 ° C pendant la nuit. Sédimenter les cellules par centrifugation du bloc pendant 30 min à 4000 rpm. Décanter le surnageant et tapotez le dessus du bloc sécher avec une serviette en papier. Mini-prep utilisant un Qiagen 96 puits appareil à vide selon les instructions du fabricant. 5. Préparation des stocks de glycérol de constructions succès clonés Transform réussi à cloner la séquence d'ADN validés dans BL21 (DE3) chimiquement des cellules compétentes conformément aux instructions du fabricant. Pour chaque construction, choisissez une seule colonie isolée de l'(DE3) transformation et inoculer BL21 dans 1 ml de 2-YT bouillon (avec 50 pg / ml de kanamycine). Secouez cultures à 3-4 heures pour 220 rpm à 37 ° C. Étiqueter un 1,5 mlvisser tube de bouchon avec le numéro unique d'identification d'assemblage, de la souche de cellules, et la date. Ajouter 500 ul de 50% de glycérol et 500 pi de culture cellulaire et inverser plusieurs fois. Stocker immédiatement du stock de glycérol sur la glace sèche ou dans un congélateur à -80 ° C. 6. Test d'expression Lysis Buffe r Tampon de lavage tampon d'élution 50 mM de NaH 2 PO 4 à pH 8,0 NaCl 300 mM 10 mM d'imidazole 1% de Tween 20 MgCl2 2 mM 0,1 pl / ml benzonase 1 mg / ml de lysozyme 50 mM de NaH 2 PO 4 à pH 8,0 NaCl 300 mM 20 mM d'imidazole 0,05% de Tween 20 Tris 25 mM, pH 8,0 NaCl 300 mM 250 mM imidazole 0,05% de Tween 20 * Ajouter benzonase, lysozyme,et l'inhibiteur de la protéase immédiatement avant la lyse. Morts à un échantillon à partir du stock de glycérol sur la kanamycine agar sélectif et incuber une nuit à 37 ° C. Démarrer une pré-culture non inducteur dans un bloc de 96 puits à fond rond; inoculer 1,2 ml de bouillon de TB (avec 50 mg / ml de kanamycine) complémenté avec 0,5% de glucose avec un E. fraîchement cultivés coli isolent. Croître pendant la nuit en agitant à 220 rpm à 37 ° C. Après une nuit de croissance, commencer cultures d'induction en inoculant 1,2 ml de bouillon de TB (avec 50 mg / ml de kanamycine) supplémenté avec Novagen Overnight Express System 1 (selon le protocole du fabricant) avec 40 pl de la pré-culture. Cultiver les cultures d'induction à petite échelle à 20 ° C pendant 48 heures, en agitant à 220 rpm. Récolte des cellules par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min, verser le surnageant et conserver à -20 ° C pendant au moins 1 heure avant le traitement. Dans le bloc 96 puits, remettre en suspension les culots cellulaires dans un tampon de lyse 300 pi. </li> Incuber les cellules dans un tampon de lyse à la température ambiante pendant 30 min suivie d'une lyse mécanique par agitation vigoureuse pendant 30 minutes à température ambiante. Clarifier le lysat brut par centrifugation pendant 30 min à 4000 rpm à 4 ° C. Utiliser une pipette multi-canal pour transférer 200 pl du lysat clarifié (fraction soluble) à un plateau de 96 puits à fond plat (Qiagen). Pour chaque puits contenant un échantillon, ajouter 40 billes Ni-NTA magnétiques ul (Qiagen). Agiter doucement la plaque sur une bascule pendant 1 heure à 16 ° C. Placer la plaque sur une plaque de poste magnétique (Qiagen) et enlever la fraction soluble non lié. Prenez soin de ne pas la pipette sur une des perles de Ni-NTA. Retirer la plaque de la plaque de poste et remis en suspension doucement les perles dans un tampon de lavage 200 pi. Introduire à la pipette de haut en bas pendant 30 secondes, puis placez la plaque arrière sur la plaque poste. Retirez le tampon de lavage et répétez l'étape 6.12. Retirer la plaque de la plaque de poste et éluer le Ni-NTA lié TAprotéines rget par lavage avec 50 tampon d'élution ul pendant 5 min. Revenir plaque de fond plat à la plaque magnétique de poste et de les transférer à l'élution d'une plaque à fond en V à 96 puits fraîche. Transférer 20 ul de l'élution sur une plaque de v-bas frais de 96 puits et de réagir avec 1 pl Ulp1 protéase. Selon le protocole du fabricant, d'analyser le Ulp1 fraction élue et élue + par électrophorèse capillaire en utilisant un LabChip 90. Sinon, toutes les fractions du test d'expression peuvent être analysées par SDS-PAGE. 7. Grand fermentation à l'échelle Utiliser un embout de pipette stérile pour obtenir une égratignure d'un stock de glycérol, inoculer 100 ml de bouillon de TB (avec 50 mg / ml de kanamycine) et de croître pendant la nuit. Agiter à 220 tpm et 37 ° C. Après une nuit de croissance, développez pré-culture en inoculant 1 L de bouillon de TB avec des solutions auto-induction EMD (voir le protocole du fabricant) (avec 50 mg / ml de kanamycine) dans un flacon dérouté 2 avec 10 ml de lapré-culture (dilution 1:100). Agiter les cultures expansées 1 L à 37 ° C; changer la température de l'incubateur agité à 20 ° C lorsque la densité optique de 0,6 (DO 600) est atteinte. Après une nuit de croissance, jetez un représentant aliquote de 10 ml de chaque construction pour les tests d'expression. cellule de récolte coller par centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min et éliminer le surnageant. cellule de congélation coller à -80 ° C. EPURATION DE PROTÉINES Tampons: tampon de lyse Tampon A (équilibration) Buffer B (élution) Dimensionnement tampon de colonne Tris 25 mM, pH 8,0 NaCl 200 mM 0,5% Glycérine 0,02% de CHAPS 10 mM d'imidazole 1 mM PTCE 50 mM d'arginine 5 benzonase ul À 100 mg lysozyme 3 comprimés inhibiteurs de la protéase (sans EDTA) Tris 25 mM, pH 8,0 NaCl 200 mM 10 mM d'imidazole 1 mM PTCE 50 mM d'arginine 0,25% Glycérine Tris 25 mM, pH 8,0 NaCl 200 mM 200 mM d'imidazole 1 mM PTCE Tris 25 mM, pH 8,0 NaCl 200 mM 1% Glycérine 1 mM PTCE * Ajouter benzonase, lysozyme, et des comprimés inhibiteurs de la protéase à chaque échantillon de 150 ml immédiatement avant la lyse. 8. lyse cellulaire Faire 2 L de tampon de lyse, ne pas ajouter lysozyme, comprimés inhibiteurs de la protéase ou benzonase (chaque échantillon sera lysée séparément dans 150 ml de tampon de lyse). cellule de dégel et remettre en suspension coller dans un tampon de lyse à une masse 1:5 ratio de volume en agitant vigoureusement pendant 30 min à 4 ° C. Cassez les morceaux en vrac des côtés du récipient à l'aide d'une spatule propre. Pendant cette période de temps préparer Ni et DialyTampons sis Sur la glace, la lyse des cellules en utilisant un appareil à ultrasons Misonix (70% de puissance, 2 sec on / off 1 sec impulsions pendant 3 min) et doucement conteneur de turbulence pour éviter la surchauffe. Enregistrer une petite (200 pl) aliquote de lysat brut pour une analyse ultérieure. Clarifier le lysat brut par centrifugation à 18.000 g pendant 35 min à 4 ° C, recueillir le surnageant et sauver un petit (200 pi) aliquote pour une analyse ultérieure. Magasin granulés à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit confirmé la protéine a été lysées dans la fraction soluble. 9. Setup Maker Protéines Pre-run Avec le fabricant de protéines allumé et le logiciel ouvert, initialiser l'instrument. Une fois initialisé, fixez un 5,0 ml GE HisTrap colonne Nickel-chélate FF Healthcare (colonne Ni) sur une ligne distincte du portique pour chacun des échantillons. Exécuter volumes de colonne 3-4 (CV) de tampon d'équilibrage à travers chaque colonne. Premier l'équilibrage et les lignes de tampon d'élution. Equilibrmangé les colonnes en aspirant tampon A travers la colonne une fois. 10. Nickel 1 (Ni1) Colonne Laver chaque colonne avec 20 ml d'eau Milli-Q pour éliminer le tampon de stockage. Exécuter 5 ml de tampon B et 25 ml de tampon A pour atteindre l'équilibre. Chargez le lysat clarifié contenant la protéine solubilisée dans les colonnes à un taux de 2 ml / min puis suivre par un lavage à 15 ml avec le tampon A. On élue la protéine liée à un gradient progressif avec des tampons A et B par les ratios suivants respectueusement: 5 ml 95:5, 60:40 5 ml, 10 ml 0:100. Recueillir chaque fraction d'élution séparément. Analyser: fractions éluées, lysat brut, lysat clarifié et écoulement continu par SDS-PAGE. fractions de piscine contenant de la protéine et en utilisant un Nanodrop pour mesurer A 280 pour déterminer approximativement la quantité de protéine présente. 11. Ulp1 Clivage Gardez une petite aliquote (250 pi) de la piscine Ni1 de colonne pour l'analyse de gel ultérieur. Apportez le restede la piscine Ni1 à 10 ml et ajouter ubiquitine protéase 1 (Ulp1) à 1 pl / 5 mg de protéine totale pour enlever l'étiquette d'affinité His-Smt. Dialyser la piscine Ni1 + Ulp1 contre 2 L de tampon A pendant 4 heures à 4 ° C en 10 kDa de coupure de poids moléculaire (MWCO) sur une plaque d'agitation à 4 ° C. Après dialyse, exécutez SDS-PAGE de Ni1 piscine et Ni1 piscine + Ulp1 pour déterminer si Ulp1 clivage a réussi. 12. Nickel 2 (Ni2) Colonne Charger protéine clivée au cours de la même colonne de Ni et répéter les étapes 9.3 à une vitesse d'écoulement réduite de 1 ml / min. La balise hors clivée se lie à la colonne et la protéine cible tagless va maintenant Flow-Through. Recueillir le flux continu dans un récipient frais. Laver la colonne Ni avec un tampon de 3 ml Un suivi par 5 ml de tampon B pour éluer toute sa protéine marquée et non spécifiquement lié. Recueillir chaque fraction séparément. Exécuter SDS-PAGE de Ni2 accréditives, laver et Ni2 fractions d'élution pour vérifier Ulp1 clivage et qui protein est présent dans l'effluent. Utilisation d'un Nanodrop pour mesurer A 280 pour déterminer approximativement la présence de la protéine. 13. Concentrant Concentrer le flux continu Ni2 (et Ni2 élution si la protéine est présente) à 5 ml avec un Ultra 10 kDa tube de centrifugeuse MWCO Amicon. Tourner dans des intervalles de 10 min à 4000 rpm à 4 ° C. Mélanger avec une pipette entre chaque tour de roue pour empêcher la protéine de trop se concentrer sur la membrane. 14. Chromatographie d'exclusion stérique (SEC) Mettre en place un S-100 10/30 GL colonne Sephacryl (GE Healthcare) en équilibrant avec un tampon SEC 200 ml à un débit de 0,5 ml / min sur un système AKTApurifier (GE Healthcare). Préparer superliaisons 10 ml pour une utilisation sur la colonne SEC conformément aux instructions du fabricant. En utilisant une seringue de 5 ml, charger les échantillons sur superliaisons et commencer la course SEC. Surveiller la trace absorbance UV à 280 nm tout en collectant petit volume fractions. Exécuter fractions SEC par SDS-PAGE. Mutualiser les fractions SEC montrant les bandes d'intensité les plus élevés. Concentrez fractions SEC communs. Reportez-vous à l'étape 13.1. protéines aliquote dans 100 échantillons ul, gel rapide dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. CRISTALLISATION 15. la cristallisation des protéines Pré-remplir chaque réservoir d'une plaque de cristallisation 96 puits Compact Jr (Emerald Bio) avec 80 pl de l'écran de cristallisation (Emerald Bio) de son choix. Diluer protéine avec dimensionnement tampon à 2-20 mg / ml et conserver dans la glace. Verser 0,4 l de protéines et 0,4 ul de l'écran de cristallisation dans chacun des 96 puits et couvrir avec du ruban d'étanchéité cristalline (Manco). Conservez la plaque à 16 ° C tout en vérifiant pour la cristallisation des protéines périodiquement au cours des prochaines semaines sous un microscope à dissection. 16. Cristal récolte </ P> Créer un cryoprotecteur à partir de la liqueur mère et de l'éthylène glycol. Couper le ruban transparent qui recouvre le puits avec le cristal de protéine cible. Pour un puits vide, ajouter 1,6 ul de la condition de cristallisation correspondante et se combiner avec 0,4 l de l'éthylène-glycol qui donne une concentration finale de 20% d'éthylène glycol et 80% de cristallisation état. Remarque: pour optimiser diffraction cristal essayer différents cryoprotecteurs tels que le glycérol, les huiles, les polyéthylène glycols MW faibles, et / ou à des pourcentages de la cryoprotectant variable. Avant de récolter refroidir une rondelle ALS-style dans un vase de Dewar rempli d'azote liquide et fermer le couvercle. Récolter le cristal en plaçant une boucle cryogénique avec le diamètre intérieur correspondant à la taille du cristal sur une baguette de cristal magnétique (Hampton Research) et enlever le directement à partir de la solution ainsi. Plonger immédiatement la boucle cryogénique avec le cristal récolté dans le puis plongez cryoprotecteur dans la rondelle ALS-style à clignoter geler le crystal. Répéter pour un nombre souhaité de cristaux. 17. Cristal dépistage / Collecte de données Une fois la récolte terminée utiliser une baguette rondelle à placer le couvercle rondelle cryo magnétique sur la SLA rondelle. Avec des pinces coudées, retourner la rondelle à l'envers. Transférer la rondelle à un Rigaku ACTEUR Dewar, visser une Pusher Puck sur la rondelle, et percer le couvercle laissant dans le vase de Dewar avec des épingles face. En utilisant le logiciel JDirector, écran chaque cristal sous les paramètres suivants: fente de faisceau fixé à 0,5 degrés, la distance du détecteur fixé à 50 mm, l'étape d'image à 70 degrés, et la longueur d'exposition réglé à 30 sec. Exécuter MOSFLM sur les images de test que vous avez prises avec JDirector pour déterminer quelle est la meilleure stratégie est de cristal et de collecte de données. Recueillir un ensemble de données complet basé sur vos résultats de MOSFLM. 18. Traitement de données / Détermination de la structure Exécuter XDS / XSCALE 4 à traiter l'ensemble des données. Ouvrez le logiciel de bain CCP4. Exécuter Phaser 5 pour calculer une solution de remplacement moléculaire en utilisant un modèle de recherche d'homologie élevé, lorsqu'il y en a. Dans ce cas, nous avons utilisé le 3CW4 PDBID comme un modèle de recherche 6. Exécuter Refmac 7 pour affiner votre modèle moléculaire contre la réflexion observée recueillies dans l'ensemble de données. Résolution finale devrait être basé hors de la coquille et plus déterminée par les paramètres suivants: R facteur> 50%, I / sigma> 2, et l'exhaustivité> 90%. Construire un modèle de densité électronique en 3 dimensions avec le logiciel graphique moléculaire COOT 8. Avant de déposer la structure de l'APB valider avec le logiciel de MolProbity 9 pour vérifier que la qualité de la structure est appropriée pour le dépôt.