インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

プロトコルの概要を図1に示す。 分子生物学 1。デザインを構築タンパク質構築とコドン設計合成遺伝子配列を設計する遺伝子Composerソフトウェアを使用してください。ジーンComposerソフトウェアの使用は、他の場所で3詳細に提供されています。 アライメントビューアモジュールを使用し、タンパク質配列アラインメントを比較し、タンパク質構造を定義するためにデザインモジュールを構築します。 （ 図2）可能であれば、タンパク質構造データバンク（PDB）に同族からの一次および3次元構造要素の両方にターゲットのアミノ酸配列の位置を合わせます。 一次構造の保全と同族の立体構造に基づいて、新しい末端を選択することによって、構造誘導構造の設計を行うためにアライメント情報を使用します。 デザイン挿入PCR（iPCRを）とベクトルPCR（VPCR）アンプリマー（端末プライマー）。 ジーンCを使用したomposerのタンパク質対DNAアルゴリズムは、コドン設計された核酸配列内に構築されるアミノ酸配列を逆変換する。 E.での発現のための配列を最適化するための適切なコドン使用テーブル（CUT）を使用大腸菌 。 実質的にN末端6×ヒスチジンタグおよび容易な精製を可能にするSmt3/SUMO融合タンパク質を組み込むように修正pET28ベク​​ターにインサートをクローニングする。 DNA 2.0と統合されたDNAの技術からの注文プライマーを用いて合成遺伝子の順序を置くこと。 2。ポリメラーゼ不完全なプライマー伸長（PIPE）クローニングプライマーおよび遺伝子を準備 1分間1,000 rpmでプライマーを含むベンダー提供のプレートを遠心分離します。 100μMにプライマー濃度を持参し、50μlのTEバッファーを追加します。 96ウェルV底プレートに脱イオン（DI）水で10μMにプライマーを希釈します。 1分間1,300 rpmで1.5 mlのチューブにベンダー提供の遺伝子を遠心分離します。 <li> TEバッファーを使用して、50 ngの/μlに各チューブのDNA濃度をもたらす。 1.5 mlのチューブに、10 ngの/μlに各プライマーの希釈液を作る。 使用しないときは-20℃で保存プライマーと遺伝子。 PCR（iPCRを）を挿入準備氷の上でPfuのマスターミックスのバイアルを解凍、室温で遺伝子とプライマーを保つ。 プライマーセットにプレートマップ割り当てる井戸を作成し、構築します。 96ウェルPCRプレートの各ウェルに、DI水の13μLを加える。 各ウェルの間にヒントを変更するために確保し、プレートマップに従って96ウェルプレートの各反応を楽しみに5μlのとリバースプライマーの5μLを加える。 ウェルプレートマップに従ってその適切に各全長遺伝子の2μLを加える。 各ウェルの間にヒントを変更するために確保し、各ウェルにPfuのマスターミックス25μLを加える。 以下のPCR条件を用いて反応サイクル： 95℃で2分</李> 95℃30秒 50°C 45秒 68℃で3分 4℃∞ 25サイクルのステップBDを繰り返します。 新たな96ウェルPCRプレートに各iPCRを反応液10μlを移す。 各サンプルに6X負荷色素の3μLを加える。 フラグメントの増幅を確認するために、100〜500 bpsのDNAラダーの隣に110 Vで1％TAE EtBrをアガロースゲル上で各サンプルを分離する。 -20°Cで保存iPCRを製品使用しないときは（凍結融解を極力避けるため）。 3。ベクトルPCR（VPCR）を準備 形質転換の一晩培養を開始プラスミドpET28ベクターを大腸菌 。 50μgの/ mlのカナマイシンを2-YTブロス2個の5 mlチューブに接種。 220rpmで37℃で一晩培養°シェーカーでCを育てる。 15分間3,000 rpmで遠心分離することによって一晩成長後の文化をスピンダウン。 キアゲンQIAを使用プレップスピンミニプレップキットは、製造元の指示に従って、細菌ペレットからpET28ベク​​トルを抽出する。 抽出pET28プラスミドのセットアップ制限酵素消化。 pET28ベク​​トルの20μlに10倍のBamHIバッファー2.2μL及びBamHIとHindIIIを1μlを追加します。 37℃で1時間反応をインキュベート℃でゲル上の別の消化産物。 2.2.10手順を参照してください。 ゲルからベクトル帯域をカットし、製造元の指示に従ってをQIAquickゲル抽出キットを用いて精製する。 光度計を用いて、DNA濃度を定量化する。 は10ng /μlにベクトルをカット希薄。 -20°C使用しないときに保管してください。 VPCRプライマーを準備します。 1,300 rpmで1分間IDT供給oligonucliotidesを遠心分離。 DI水で100μMの濃度を持参。 1.5mlチューブの両方のフォワードおよびリバースプライマーの10μMの希釈を準備します。 -20℃で保存プライマーおよびプライマー希釈室温で氷の融解テンプレートとプライマーでPfuのマスターミックスを解凍。 96ウェルPCRプレートのセットアップVPCR反応： 96ウェルプレートの最初の行では、順方向および逆方向の両方VPCRプライマー60μlの消化pET28テンプレート（10 ngの/μL）の24μLを兼ね備えています。 12チップマルチチャンネルピペットを用いて、プレートのウェル残りの各プライマーとテンプレートマスターミックス12μLを移す。これは、プレートの各ウェルにおけるプライマーとテンプレートマスターミックス12μlのになるはず。 各ウェルにDI水13μLを加える。 各ウェルにPfuのマスターミックス25μlのを追加します。 ステップ2.2.7で使用したPCR条件を通じサイクルが反応。 15ミリリットルファルコンチューブにVPCR反応のプールすべて。 消化pET28ベク​​トルのゲル（予想される長さにプールされたPCR産物10μlのを分離することによってフラグメント増幅を確認約6 KB）です。 2.2.10手順を参照してください。 プレートをマージする準備をします。 96ウェルV字底プレートの各ウェルにVPCR産物のアリコート3μlの。 -20で保存プレート°iPCRを製品とマージされるまでC。 4。 iPCRをとVPCR製品をマージ解凍iPCRを製品や室温での事前分注しVPCR 96ウェルマージプレート。 マージプレートの、それぞれのウェルに各iPCRを製品の3μLを加える。 トップテン化学的にコンピテント細胞にプレートをマージ変換。 ベンダー提供のケミカルコンピテント細胞の単一50μlをチューブに各マージ反応2μlのを追加し、製造業者の供給するプロトコルを進める。 変換プレートから各構築のために一晩培養を準備します。 ディープウェルブロックの各ウェルに25ミリリットル滅菌容器からアリコートを5ml TBブロス（50μgの/ mlのカナマイシンを含む）。 殺菌を使用したル技術は、各変換プレートから単離したコロニーを選択し、ディープウェルブロックの適切な十分に接種。 Airporeカバー付きブロックをカバーしています。 37℃で一晩220 rpmでブロックを横に振る。 4,000 rpmで30分間ブロックを遠心分離により細胞をペレット化。 上清を捨て、ペーパータオルで乾燥したブロックの上部をなでる。 ミニプレップは、製造業者の指示に従ってキアゲン96ウェル真空装置を用いた。 5。に成功クローン構築のグリセロールストックを準備する正常に製造業者の指示に従ってBL21（DE3）コンピテント細胞に化学的に配列検証DNAをクローニングし、トランスフォーム。 各構築物については、2 – YTブロス1mlの（50μgの/ mlのカナマイシンを含む）にBL21（DE3）形質転換および接種から単一の孤立したコロニーを選択します。 37℃で3-4時間、220rpmで文化を振る℃に 1.5ミリリットルにラベルを付けユニークな構造の識別番号、細胞株、および日付とキャップチューブをねじ込みます。 50％グリセロール500μlの細胞培養液500μlを加え、数回転倒。直ちにドライアイス上または-80℃の冷凍庫中のグリセロールストックを格納します。 6。式のテスト 溶解Buffe R バッファを洗う 溶出緩衝液 50mMののNaH 2 PO 4、pH8.0で 300mMのNaClを 10 mMイミダゾール 1％のTween 20 2 mMのMgCl 2を 0.1μL/ mlのベンゾナーゼ 1 mg / mlのリゾチーム 50mMののNaH 2 PO 4、pH8.0で 300mMのNaClを 20 mMイミダゾール 0.05％のTween 20 25mMトリス、pH8.0の 300mMのNaClを 250 mMイミダゾール 0.05％のTween 20 *追加ベンゾナーゼ、リゾチーム、溶解直前とプロテアーゼ阻害剤。 ストリークはカナマイシン選択寒天の上にグリセロールストックからのサンプルと37℃で一晩インキュベート℃、 96ウェル丸底ブロックで非誘導前培養を開始し、新たに成長し、E.、0.5％グルコースを補っ接種1.2ミリリットルのTBブロス（50 mg / mlのカナマイシンを含む） 大腸菌は分離します。一晩37℃で220 rpmで振盪育つ一晩増殖させた後、前培養の40μLでNovagen社一晩Expressシステム1（製造業​​者のプロトコールに従って）を補充TBブロス1.2mlのを（50 mg / mlのカナマイシンを含む）接種することによって誘導培養を開始します。 220 rpmで振盪、48時間20℃で小規模誘導文化を育てる。 15分間4,000 rpmで遠心分離によって収穫細胞は、処理前に少なくとも1時間-20℃で上清と店舗°Cをオフに注ぐ。 96ウェルブロックに、300μlの溶解緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁する。 </lI> 激しく室温で30分間振盪することによって機械的溶解、続いて30分間室温で溶解緩衝液で細胞をインキュベートする。 4℃で4,000 rpmで30分間遠心分離により粗溶解物を明確にする 96ウェル平底トレー（キアゲン）に明らかライセート（可溶性画分）を200μlを転送するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。サンプルウェルを含むそれぞれについて、40μlのニッケル-NTA磁気ビーズ（キアゲン）を追加します。 ゆっくりと16℃で1時間のためにロッカーにプレートを攪拌磁性支柱プレート（キアゲン）上にプレートを置き、結合していない可溶性画分を削除します。のNi-NTAビーズのいずれかをピペットではないように注意してください。 ポストプレートからプレートを取り外し、ゆっくり200μlの洗浄バッファーでビーズを再懸濁した。ペッティング上下30秒間、その後ポストプレートにバックプレートを配置。 洗浄バッファーを外し、ステップ6.12を繰り返します。 ポストプレートからプレートを取り外し、TAをバインドのNi-NTAを溶出5分間50μlの溶出緩衝液で洗浄することによりrgetタンパク質である。 磁性支柱プレートに平らな底板を返し、新鮮な96ウェルV底プレートに溶出を転送します。 新鮮な96ウェルV底プレートに溶出液20μlを移し、1μlのULP1プロテアーゼと反応する。 製造業者のプロトコルに従って、ラボチップ90を用いてキャピラリー電気泳動によって溶出し、溶出+ Ulp1画分を分析する。 あるいは、発現試験のすべての画分をSDS-PAGEにより分析することができる。 7。大規模発酵グリセロールストックからスクレープを取得するために滅菌ピペットチップを使用し、100ミリリットルのTBブロス（50 mg / mlのカナマイシンと）を接種し、一晩成長。 220rpmで振ると37℃ 一晩増殖させた後、10mlの2 Lバッフル付きフラスコにEMDの自己誘導ソリューション（製造業者のプロトコールを参照）（50 mg / mlのカナマイシンを含む）とTBブロスの1 Lを接種し前培養を拡大前培養（1:100希釈）。 37℃で発泡1 L培養物を振る°C; 20に振盪インキュベーターの温度を変化°C 0.6（OD 600）の光学密度に達したとき。 一晩増殖させた後、式のテストのために各構築物の代表を10mlのアリコートを取る。 収穫セルは15分間5,000 rpmで遠心分離することにより貼り付け、上澄み捨てる。 -80℃で貼り付ける凍結細胞℃、 タンパク質精製バッファ： 溶解バッファー （平衡）バッファ バッファーB（溶出） サイジングカラム緩衝液 25mMトリス、pH8.0の 200mMのNaClを 0.5％グリセロール 0.02％CHAPS 10 mMイミダゾール 1 mMのTCEP 50mMのアルギニン 5μlのベンゾナーゼ 100メートルGリゾチーム 3プロテアーゼ阻害剤錠（EDTAフリー） 25mMトリス、pH8.0の 200mMのNaClを 10 mMイミダゾール 1 mMのTCEP 50mMのアルギニン 0.25％グリセロール 25mMトリス、pH8.0の 200mMのNaClを 200 mMイミダゾール 1 mMのTCEP 25mMトリス、pH8.0の 200mMのNaClを 1％グリセロール 1 mMのTCEP *直ちに溶解前に各150ミリリットルサンプルにベンゾナーゼ、リゾチーム、およびプロテアーゼ阻害剤錠を追加します。 8。細胞溶解溶解緩衝液2 Lを作り、リゾチーム、プロテアーゼ阻害剤、錠剤またはベンゾナーゼ（各試料を溶解緩衝液150mlに溶解し、別途説明する）を追加しない。 融解と再懸濁細胞は1:5質量で溶解バッファーに貼り付ける：体積比を精力的に4で30分間攪拌℃とすることによりきれいなスパチュラを用いてビーカーの側面から緩いチャンクを破る。この間の期間は、Niと日記を準備SISバッファ氷の上で、Misonix超音波処理（3分で70％の電力、2秒オン/ 1秒オフパルス）と過熱を防ぐため優しくスワールコンテナを用いて細胞を溶解する。将来の分析のための粗溶解物の小（200μl）をアリコートを保存します。 、4℃で35分間、18,000×gで遠心分離により粗溶解°Cを明確に上清を収集し、将来の分析のために小（200μl）をアリコートを保存します。それが確認されるまで4で保存ペレット°Cタンパク質が可溶性画分に溶解されています。 9。プリランプロテインメーカーのセットアッププロテインメーカーでオンとソフトウェアが開き、機器を初期化します。 一度初期化された、サンプルの各々のためのガントリーの別の行に1 5.0ミリリットルGEヘルスケアHisTrap FFニッケルキレートカラム（ニッケルカラム）を添付してください。 各カラムを通して平衡化バッファーの3-4カラム容量（CV）を実行します。 総理平衡および溶出バッファーライン。 Equilibr一度カラムを通してバッファを吸引して、列を食べました。 10。ニッケル1（NI1）カラムストレージ·バッファを削除するには、20ミリリットルのMilli-Q水で各カラムを洗浄。 5ミリリットル緩衝液Bと平衡化のために25ミリリットルバッファを実行します。 2ミリリットル/分の速度でカラムに可溶化されたタンパク質を含むライセートをロードし、バッファAと15ミリリットルの洗浄でフォローバッファ丁重に以下の比率でAとBとの段階勾配で結合タンパク質を溶出：5ミリリットル95:5、5ミリリットル60:40、10ミリリットル0:100。個別に各溶出画分を収集します。 分析：溶出画分、粗溶解物、明らかライセート、フロースルーをSDS-PAGEで。プール画分を、タンパク質を含有し、ほぼ存在するタンパク質の量を決定するために280を測定するための光度計を使用する。 11。 ULP1切断その後のゲル分析用NI1列プールの小アリコート（250μlの）を保つ。残りを持参10ミリリットルにNI1プールおよびHis-SMT親和性タグを削除するには、1μL/総タンパク5mgのでユビキチン様プロテアーゼ1（ULP1）を追加します。 4℃で撹拌プレート上で10 kDaの分子量カットオフ（MWCO）に4℃で4時間のためのバッファの2 Lに対してNI1プール+ ULP1を透析透析後、NI1プールとNI1プールのSDS-PAGEを実行する+ ULP1 ULP1切断が成功したかどうかを判断する。 12。ニッケル2（をNi2）カラム同じニッケルカラムに切断されたタンパク質をロードし、1ml /分の減少流量でステップ9.3を繰り返します。タグは、カラムに結合され、タグなし、標的タンパク質は、今では流れます切断。新鮮な容器にフロースルー収集。 3ミリリットルバッファーでニッケルカラムを洗浄すべてのHisタグと非特異的に結合したタンパク質を溶出するために緩衝液Bを5mlが続く。個別に各画分を収集します。 をNi2のSDS-PAGE洗う、フロースルーとをNi2溶出画分ULP1裂を確認すると、その実行PRoteinは、フロースルー中に存在する。ほぼタンパク質の存在を決定するために280を測定するための光度計を使用する。 13。集中をNi2フロースルー（とをNi2溶出タンパク質が存在する場合）5ミリリットルにアミコンウルトラの10kDa MWCOの遠心チューブを集中。 4℃で4,000 rpmで10分間隔でスピン膜に沿って過集中からタンパク質を防ぐために各スピンの間にピペットで混ぜる。 14。サイズ排除クロマトグラフィー（SEC） 0.5ミリリットル/ AKTApurifierシステム（GEヘルスケア）に分の流速で200ミリリットルSECバッファーで平衡化することによりセファクリルS-100 10月30日GLカラム（GEヘルスケア）を設定します。 製造元の指示に従って、SECカラムで使用するための10ml superloopsを準備します。 5ミリリットル注射器を用いて、superloopsにサンプルをロードし、SECの実行を開始します。 少量FRを収集しながら、280nmでのUV吸光度トレースを監視するアクション。 SDS-PAGE経由SEC画分を実行します。 最高強度のバンドを示すSEC画分をプール。 プールされたSEC画分を集中。 13.1のステップを参照してください。 100μlのサンプルを、-80℃で液体窒素とストアのフラッシュ凍結℃までにアリコートタンパク質晶析 15。タンパク質結晶化選択肢の結晶画面80μlの（エメラルドバイオ）で96ウェルコンパクトジュニア結晶化プレートの各貯水池（エメラルドバイオ）を事前記入してください。 氷の上に2-20 mg / mlのとストアにバッファのサイジングでタンパク質を希釈します。 96ウェルのそれぞれにタンパク質と結晶化画面の0.4μlの0.4μLを分注し、クリスタルクリアなシールテープ（マンコ）でカバーしています。 解剖顕微鏡下で、今後数週間にわたって定期的にタンパク質結晶化のために確認しながら、16℃でプレートを保管してください。 16。クリスタル収穫</ P> 母液とエチレングリコールから凍結防止剤を作成します。標的タンパク質の結晶とよくをカバーする明確なテープをカットします。よく空には、対応する結晶化条件の1.6μlを添加し、20％エチレングリコールと80％の結晶化条件の最終濃度が得られるエチレングリコールの0.4μlのと組み合わせる。注：グリセリン、オイル、低分子量ポリエチレングリコール、および/または凍結保護剤の割合を変えることで、次のような別の凍結保護剤を試して結晶回折を最適化する。 ふたが付いている液体窒素とカバーでいっぱいデュワーにおけるALS-スタイルパッククールダウン収穫前。 マグネティッククリスタルワンド（ハンプトンリサーチ）よく溶液から直接すくうの結晶の大きさに一致する内径CryoLoopを配置することにより、結晶を収穫。 すぐにCを凍結フラッシュするALS-スタイルパックに凍結防止剤その後水没に収穫されたクリスタルでCryoLoopを浸しrystal。結晶は、所望の数のために繰り返します。 17。クリスタルスクリーニング/データ収集一度収穫ALSパックに磁気冷凍パックの蓋を置くためにパックの杖を使って完了です。曲がったトングと、パックを逆さまに反転させます。 リガクACTORデュワーにパックを移し、パックにパックプッシャーをねじ込むと、表向きピンとデュワーでそれを残して蓋をオフにパンチ。 JDirectorソフトウェアを使用して、次のパラメータの下画面の各クリスタル：0.5度に設定されたビームスリット50 mmとし、検出器の距離は、70度にイメージステップと、露光の長さは30秒に設定されています。 あなたは最高の結晶と戦略は、データ収集のために何であるかを決定するためにJDirectorで撮影したテスト画像でMOSFLMを実行します。 MOSFLMからあなたの結果に基づいて、完全なデータセットを収集します。 18。データ処理/構造決定データセットを処理するためにXDS / XSCALE 4を実行します。 CCP4 Suiteソフトウェアを開きます。 利用可能な場合、高い相同性検索モデルを用いた分子置換ソリューションを計算するフェイザー5を実行します。このケースでは、検索モデル6としてPDBID 3CW4を使用していました。 データセット内の収集、観測反射照らし合わせて分子モデルを絞り込むことREFMAC 7を実行します。最終的な解像度が高いシェルのオフに基づいて、以下のパラメータによって決定されるべきである：Rファクター> 50％、I /シグマ> 2、および完全性> 90％。 分子グラフィックソフトウェアCOOT 8で3次元電子密度モデルを構築します。 PDB構造を堆積する前に構造の質が堆積するのに適していることを確認するMolProbity 9ソフトウェアでそれを検証します。