Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Uma visão geral do protocolo é apresentado na Figura 1. Biologia Molecular 1. Construir projeto Use software Composer Gene para projetar construção de proteínas e seqüências de genes sintéticos projetados códon. O uso de software Compositor genética tem sido oferecido em detalhe noutro local 3. Use o módulo Visualizador de Alinhamento e construir módulo de desenho para comparar alinhamentos de seqüência de proteínas e definir a construção de proteínas. Alinhar a sequência de aminoácidos alvo para ambos os elementos estruturais primárias e 3D de homólogos do Protein Data Bank (PDB), se estiverem disponíveis (Figura 2). Use as informações de alinhamento para fazer desenhos constroem estrutura guiadas por escolha de novos terminais baseados na conservação da estrutura primária e estruturas 3D de homólogos. Projeto de inserção PCR (IPCR) e vetor de PCR (VPCR) amplímeros (terminal primers). Utilizando Gene Calgoritmo de proteína e ADN da omposer, volta-traduzir a sequência de aminoácidos em constructo codão sequência de ácido nucleico de engenharia. Use a tabela de uso códon adequada (CUT) para otimizar a seqüência de expressão em E. coli. Virtualmente clonar inserção em pET28 vector modificado para incorporar uma tag de Histidina N-terminal e 6x Smt3/SUMO proteína de fusão que permite a fácil purificação. Coloque ordem gene sintético com DNA 2.0 e primers ordem de Tecnologias Integradas de DNA. 2. Polymerase incompleta Extensão Primer (PIPE) Clonagem Prepare Primers e Genes Centrifugar as placas disponibilizados pelos fornecedores, contendo primers a 1.000 rpm por 1 min. Levar a concentração dos iniciadores para 100 uM e adicionar 50 ul de tampão TE. Dilui-se iniciadores a 10 uM, com água desionizada (Dl) em uma placa de fundo em V de 96 poços. Centrifugar o gene fornecido pelo fornecedor em um tubo de 1,5 ml a 1.300 rpm por 1 min. <li> Usando tampão TE, trazer a concentração de ADN de cada tubo a 50 ng / mL. Em tubos de 1,5 ml, fazer diluições de cada primer a 10 ng / mL. Loja de primers e genes a -20 ° C, quando não estiver em uso. Prepare Insert PCR (IPCR) Descongelar um frasco de Pfu Master Mix em gelo; manter genes e iniciadores à temperatura ambiente. Criar um mapa da placa atribuindo poços para um conjunto de primers e construir. Adicionar 13 mL de água Dl para cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Adicionar 5 uL de frente e 5 ul de iniciador reverso de cada reacção na placa de 96 cavidades de acordo com o mapa da placa, assegurando a mudar dicas entre cada poço. Adicionam-se 2 jil de cada gene de comprimento total para a sua bem adequado de acordo com o mapa do prato. Adicionar 25 ul de Pfu mistura principal para cada poço, assegurando a mudar dicas entre cada poço. Ciclo as reacções utilizando os seguintes condies de PCR: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 seg 50 ° C 45 seg 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Repita os passos bd para 25 ciclos. Transferem-se 10 ul de cada reacção de IPCR para uma nova placa de PCR de 96 poços. Adiciona-se 3 ul de corante de carga 6X a cada amostra. Separa-se cada amostra numa% de gel de agarose TAE EtBr 1 a 110 V ao lado de uma escada de 100-500 pb do ADN para confirmar a amplificação do fragmento. Loja IPCR produto a -20 ° C quando não estiverem em uso (evitar o congelamento descongelamento, tanto quanto possível). 3. Prepare Vector PCR (VPCR) Iniciar a cultura durante a noite de E. transformado coli com pET28 vector plasmídeo. Inocular dois tubos de 5 mL de caldo de 2 YT com 50 ug / ml de canamicina. Crescer as culturas durante a noite a 37 ° C, em agitador rotativo a 220 rpm. Girar as culturas após crescimento durante a noite por centrifugação a 3.000 rpm durante 15 min. Use um Qiagen QIAprep rotação Miniprep Kit para extrair pET28 vector de pelotas de bactérias de acordo com as instruções do fabricante. Restrição de configuração digestões enzimáticas de extraído pET28 plasmídeo. Adicionar 2,2 mL de tampão BamHI 10x e 1 ul de BamHI e Hindi II e 20 pi de vector pET28. Incubar a reacção durante 1 hora a 37 ° C. Produto da digestão separada em um gel. Consulte o passo 2.2.10. Cortar banda do vector a partir do gel e purificá-lo utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit de acordo com as instruções do fabricante. Usando um NanoDrop, quantificar a concentração de ADN. Diluir cortar vector a 10 ng / mL. Armazenar a -20 ° C quando não estiverem em uso. Prepare primers VPCR. Centrifugar IDT oligonucliotides fornecidos para 1 min a 1.300 rpm. Levar a concentração de 100 uM com água Dl. Prepare-se 10 mM de diluição de ambos os primers para a frente e para trás em um tubo de 1,5 ml. Loja de primers e diluições de primers a -20 ° C. Descongelar Pfu Master Mix em gelo e degelo molde e os iniciadores à temperatura ambiente. Reações VPCR de configuração em uma placa PCR de 96 poços: Na primeira fila de uma placa de 96 poços 60 ul de combinar ambos os iniciadores VPCR frente e reversa e 24 ul de pET28 digerido molde (10 ng / mL). Usando uma pipeta de múltiplos canais 12 da ponta, transferir 12 ul da mistura de iniciador e molde mestre para cada restante das cavidades da placa. Isto deve resultar em 12 ul de iniciador e molde mestre de mistura em cada poço da placa. Adicionar 13 ul de água desionizada a cada poço. Adicionar 25 ul de Pfu Master Mix para cada poço. Ciclo as reacções através das condições de PCR utilizadas no passo 2.2.7. Piscina todas as reações VPCR em um tubo Falcon de 15 ml. Verifique amplificação fragmento separando 10 ul de produto de PCR reunidos num gel (comprimento esperado de vector digerido pET28é de aproximadamente 6 Kb). Consulte o passo 2.2.10. Prepare placas de fusão. Alíquotas de 3 mL de produto VPCR em cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços. Loja de placas a -20 ° C até fusão com o produto IPCR. 4. Mesclar IPCR e VPCR produtos Produtos IPCR descongelar e pré-VPCR alíquota de 96 poços fundir placa à temperatura ambiente. Adiciona-se 3 uL de cada produto de IPCR à sua respectiva cavidade da placa de junção. Transformar placa fundir Top Ten células competentes quimicamente. Adicione 2 mL de cada reação de fusão em um único tubo de 50 ml de células quimicamente competentes fornecedor fornecidos e prosseguir com o protocolo fornecido pelo fabricante. Prepare culturas durante a noite para cada construção de chapa de transformação. Alíquotas de 5 ml de caldo TB (com 50 ug / ml de canamicina) a partir de um reservatório de 25 ml esterilizado, em cada poço de um bloco de poços profundos. Usando sterile técnica, escolher uma colônia isolada de cada placa transformação e inocular o bem apropriado do bloco de poço profundo. Cubra o bloco com uma cobertura Airpore. Agitar bloco a 220 rpm a 37 ° C durante a noite. Células pelota por centrifugação do bloco durante 30 min a 4000 rpm. Decantar o sobrenadante e pat o topo do bloco seco com uma toalha de papel. Mini-prep da Qiagen utilizando um aparato de 96 poços de vácuo de acordo com as instruções do fabricante. 5. Preparando-se Stocks de glicerol de construções clonados com sucesso Transform clonado com sucesso seqüência de DNA validados em BL21 (DE3), as células quimicamente competentes de acordo com as instruções do fabricante. Para cada constructo, escolher uma única colónia isolada a partir da (DE3) de transformação e inocula BL21 em 1 ml de caldo 2-YT (com 50 ug / ml de canamicina). Agitar culturas a 220 rpm durante 3-4 horas a 37 ° C. Rotular um 1,5 mlparafuso tubo com tampa com o número único de identificação de construto, a estirpe de células, e a data. Adicionar 500 ul de glicerol a 50% e 500 mL de cultura de células e gire várias vezes. Imediatamente armazenar estoque de glicerol em gelo seco ou num congelador -80 ° C. 6. Teste de expressão Lise Buffe r Tampão de Lavagem Tampão de eluição 50 mM de NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole a 10 mM 1% de Tween 20 MgCl2 2 mM 0,1 ul / ml de Benzonase 1 mg / ml de lisozima 50 mM de NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 20 mM Tween 20 0,05% 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 250 mM Tween 20 0,05% * Adicionar Benzonase, lisozima,e inibidores da protease imediatamente antes da lise. Causadas uma amostra a partir de estoque de glicerol em canamicina agar selectiva e incubar durante a noite a 37 ° C. Iniciar uma pré-cultura não indutoras em um bloco de 96 poços de fundo redondo; inocular 1,2 ml de caldo TB (com 50 mg / ml de canamicina), suplementado com 0,5% de glucose com um E. recentemente crescido coli isoladas. Crescer durante a noite com agitação a 220 rpm a 37 ° C. Após o crescimento durante a noite, iniciar culturas de indução por inoculação de 1,2 ml de caldo TB (com 50 mg / ml de canamicina), suplementado com Novagen noite expresso Sistema 1 (de acordo com o protocolo do fabricante) com 40 ul de pré-cultura. Crescer as culturas em pequena escala de indução a 20 ° C durante 48 horas, agitando a 220 rpm. Colheita de células por centrifugação a 4.000 rpm durante 15 minutos, deitar fora o sobrenadante e armazenar a -20 ° C durante pelo menos 1 hora antes do processamento. No bloco 96, bem, ressuspender as pastilhas de células em 300 ul de tampão de lise. </li> Incubar as células em tampão de li se à temperatura ambiente durante 30 min seguido por lise mecânica por agitação vigorosa durante 30 minutos à temperatura ambiente. Clarificar o lisado em bruto por centrifugação durante 30 min a 4000 rpm a 4 ° C. Usar uma pipeta multi-canal para transferir 200 ul do ligado clarificado (fracção solúvel) para uma bandeja de 96 poços de fundo plano (Qiagen). Para cada uma das cavidades contendo uma amostra, adicionar 40 pérolas de Ni-NTA (Qiagen magnéticos ul). Agitar suavemente a placa por um balancim durante 1 hora a 16 ° C. Coloque a placa em uma placa de pós magnética (Qiagen) e remova a fração solúvel não ligado. Tome cuidado para não pipetar qualquer das esferas Ni-NTA. Remova a placa do prato de pós e ressuspensos suavemente as pérolas em 200 ul de tampão de lavagem. Pipeta cima e para baixo por 30 segundos e, em seguida, colocar a placa de volta no prato post. Retire o tampão de lavagem e repita o passo 6.12. Remova a placa de placa de pós e eluir o Ni-NTA obrigado taproteína rPegue por lavagem com 50 ul de tampão de eluição durante 5 min. Placa de fundo plano de retorno para a chapa de pós magnéticos e transferir a eluição para uma placa de 96 poços de fundo em V fresco. Transferir 20 uL da eluição a uma placa de 96 poços de fundo em V fresco e reagir com 1 ul ULP1 protease. De acordo com o protocolo do fabricante, analisar a + fracção eluida e eluída Ulp1 por electroforese capilar utilizando um LabChip 90. Alternativamente, todas as fracções a partir de ensaios de expressão pode ser analisado através de SDS-PAGE. 7. Large Scale Fermentação Usar uma pipeta estéril para obter uma raspagem a partir de um estoque de glicerol, inocular 100 ml de caldo TB (com 50 mg / ml de canamicina) e crescer durante a noite. Agitar a 220 rpm e 37 ° C. Após o crescimento durante a noite, expandir pré-cultura por inoculação de 1 L de caldo TB com soluções autoindução Merck (ver o protocolo do fabricante) (com 50 mg / ml de canamicina) num balão de 2 confundido com 10 ml dapré-cultura (diluição 1:100). Agitar as culturas expandidas de 1 L, a 37 ° C, a mudança da temperatura da incubadora com agitação a 20 ° C quando uma densidade óptica de 0,6 (OD 600) for atingido. Após o crescimento durante a noite, ter um representante alíquota de 10 ml cada construto para testes de expressão. Colheita de células colar por centrifugação a 5.000 rpm durante 15 minutos e descartar o sobrenadante. Célula congelamento cole a -80 ° C. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Buffers: Tampão de Lise Tampão A (Equilíbrio) Tampão B (eluição) Dimensionamento tampão de coluna 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 0,5% de Glicerol 0,02% de CHAPS Imidazole a 10 mM 1 mM TCEP 50 mM de Arginina 5 Benzonase mL 100 mg lisozima 3 inibidor da protease Tablets (EDTA-free) 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl Imidazole a 10 mM 1 mM TCEP 50 mM de Arginina 0,25% Glicerol 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl Imidazole 200 mM 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 1% Glicerol 1 mM TCEP * Adicione Benzonase, lisozima e comprimidos inibidores de protease para cada 150 ml de amostra imediatamente antes da lise. 8. Lise Celular Adicione 2 L de tampão de lise; não adicionar lisozima, comprimidos inibidores de protease ou benzonase (cada amostra serão lisadas separadamente em 150 ml de tampão de lise). Descongelar e ressuspender pasta de células em tampão de lise a uma massa 01:05: relação de volume por agitação vigorosa durante 30 min a 4 ° C. Quebre os pedaços soltos de lados do copo com uma espátula limpa. Durante este período de tempo preparar Ni e Dialysis Buffers No gelo, lisar as células usando um sonicadora Misonix (70% de potência, 2 sec on / off 1 seg pulsos para 3 min) e gentilmente recipiente agite para evitar o superaquecimento. Salvar um pequeno (200 mL), alíquota de lisado bruto para análise futura. Clarificar o lisado em bruto por centrifugação a 18.000 xg durante 35 min a 4 ° C, recolhe-se o sobrenadante e guardar um pequeno (200 mL) alíquota para análise futura. Loja pelete a 4 ° C até que seja confirmada a proteína tenha sido lisadas na fracção solúvel. 9. Setup Criador Protein pré-run Com a máquina de proteína ligado e abrir o software, inicialize o instrumento. Uma vez inicializado, coloque uma coluna de 5,0 ml de níquel-quelato GE Healthcare HisTrap FF (Ni coluna) em uma linha separada do pórtico para cada uma das amostras. Executar 3-4 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio através de cada coluna. Preparar o equilíbrio e as linhas de tampão de eluição. EquilibrComeram as colunas o tampão A por aspiração através da coluna uma vez. 10. Níquel 1 (Ni1) Coluna Lava-se cada coluna com 20 ml de água Milli-Q para remover o tampão de armazenamento. Run 5 ml de tampão B a 25 ml de tampão A para o equilíbrio. Carregar o lisado clarificado contendo proteínas solubilizadas para as colunas, a uma taxa de 2 ml / min e depois seguem por uma lavagem de 15 ml com tampão A. Eluir a proteína ligada com um gradiente passo com tampões A e B pelas seguintes razões respeitosamente: 5 ml de 95:5, 5 ml de 60:40, 10 ml de 0:100. Recolher separadamente cada fracção de eluição. Analise: fracções eluídas, ligado em bruto, ligado clarificado, e por escoamento por SDS-PAGE. Piscina fracções contendo a proteína e usar um Nanodrop para medir A 280 para determinar aproximadamente a quantidade de proteína presente. 11. ULP1 Cleavage Manter uma pequena alíquota (250 ul) da piscina Ni1 coluna para análise em gel subsequente. Traga o restoda piscina Ni1 a 10 ml e adicionar a protease semelhante a ubiquitina 1 (ULP1) a 1 mL / 5 mg de proteína total para remover a marca de afinidade His-Smt. Dializar a piscina Ni1 + ULP1 contra 2 L de tampão A durante 4 horas a 4 ° C numa solução de 10 kDa de corte de peso molecular (MWCO) de uma placa de agitação, a 4 ° C. Após diálise, execute SDS-PAGE de Ni1 piscina e Ni1 piscina + ULP1 para determinar se ULP1 clivagem foi bem sucedida. 12. Níquel 2 (Ni2) Coluna Carga de proteína clivada pela mesma coluna Ni e repetir o passo 9.3, a uma taxa de fluxo reduzida de 1 ml / min. A marcação fora clivada ligarão à coluna e a proteína alvo irá agora tagless flow-through. Recolher o flow-through em um recipiente fresco. Lavar a coluna de Ni com 3 ml de tampão A seguido por 5 ml de tampão B para eluir todas as proteína marcada com His e não especificamente ligado. Recolhe cada fracção separadamente. Executar SDS-PAGE de Ni2 flow-through, lave e Ni2 frações de eluição para verificar ULP1 clivagem e que protein está presente no escoamento. Usar um Nanodrop para medir A 280 para determinar grosseiramente a presença de proteína. 13. Concentrando Concentra-se o fluxo através de Ni2 (e Ni2 eluição se a proteína estiver presente) até 5 ml com um Ultra tubo de centrífuga de 10 kDa MWCO Amicon. Girar em intervalos de 10 min a 4000 rpm a 4 ° C. Misture com uma pipeta entre cada rodada para evitar o excesso de proteína de concentração ao longo da membrana. 14. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) Configurar uma S-100 10/30 GL coluna Sephacryl (GE Healthcare) foram equilibradas com 200 ml de tampão de SEC com um caudal de 0,5 ml / min num sistema ÄKTApurifier (GE Healthcare). Preparar 10 ml superloops para utilização na coluna SEC de acordo com as instruções do fabricante. Usando uma seringa de 5 ml, carregar amostras para superloops e começar a SEC prazo. Monitorar o traço UV-absorvência a 280 nm durante a coleta de pequeno volume frações. Executar frações SEC via SDS-PAGE. Reunir as frações SEC mostrando as maiores bandas de intensidade. Concentre-se frações SEC pool. Consulte o passo 13.1. Proteína alíquota em 100 amostras il, congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. CRISTALIZAÇÃO 15. Cristalização de proteínas Pré-preencher cada reservatório de Jr placa de cristalização de 96 poços Compact (Emerald Bio) com 80 ml de tela cristalização (Emerald Bio) de escolha. Dilui-se a proteína com tampão de dimensionamento para 2-20 mg / ml e armazenar no gelo. Pipetar 0,4 mL de proteína e 0,4 ul da tela cristalização em cada um dos 96 poços e cobrir com fita de vedação cristalina (Manco). Guarde a placa a 16 ° C durante a verificação de cristalização de proteínas periodicamente ao longo das próximas semanas sob um microscópio de dissecação. 16. Cristal colheita </ P> Criar um crioprotector a partir do licor mãe e etileno-glicol. Cortar a fita transparente que cobre o poço com o cristal da proteína alvo. Para um poço vazio, adicionar 1,6 mL da condição de cristalização correspondente e combinam-se com 0,4 mL de etileno-glicol originando uma concentração final de 20% de etileno-glicol e 80% de condição de cristalização. Nota: para optimizar difracção cristal experimentar diferentes agentes crioprotectores, tais como: glicerina, óleos, polietileno-glicóis de baixo MW, e / ou em diferentes percentagens do crioprotector. Antes da colheita esfriar um disco de estilo ALS em um Dewar preenchido com nitrogênio líquido e cubra com a tampa. Recolher os cristais, colocando um CryoLoop com o diâmetro interno correspondente ao tamanho do cristal sobre uma varinha de cristal magnético (Hampton Research) e colher-lo directamente a partir da solução bem. Mergulhar imediatamente o CryoLoop com o cristal colhidas no cryoprotectant seguida submergir no disco de estilo ALS a piscar congelar o crystal. Repetir para um número desejado de cristais. 17. Cristal Coleção Triagem / Data Uma vez que a colheita está completa usar uma varinha disco para colocar o disco crio tampa magnética no ALS disco. Com pinças dobrados, vire o disco de cabeça para baixo. Transfira o disco a um Rigaku ATOR Dewar, um parafuso Pusher Puck para o disco, e perfurar a tampa deixando-o na Dewar com os pinos voltados para cima. Usando software JDirector, cada tela de cristal sob os seguintes parâmetros: fenda feixe definido para 0,5 graus, a distância detector ajustado a 50 mm, passo imagem a 70 graus, e duração de exposição definido para 30 segundos. Executar Mosflm nas imagens de teste que você tiro com JDirector para determinar qual a melhor estratégia é cristalina e para a coleta de dados. Coletar um conjunto de dados completo com base em seus resultados de Mosflm. 18. Processamento de Dados / determinação da estrutura Executar XDS / XSCALE 4 para processar o conjunto de dados. Abra o software suíte CCP4. Executar Phaser 5 para calcular uma solução de substituição molecular, utilizando um modelo de pesquisa de homologia elevado, quando disponíveis. Neste caso, usamos o 3CW4 PDBID como um modelo de pesquisa 6. Executar Refmac 7 para refinar o modelo molecular contra o reflexo observado coletadas no conjunto de dados. Resolução final deve ser baseado fora do maior shell e determinada pelos seguintes parâmetros: R fator de> 50%, I / sigma> 2, e integralidade> 90%. Construir um modelo de densidade de elétrons 3-Dimensional com o software gráfico molecular COOT 8. Antes de depositar a estrutura no APO validar com MolProbity 9 software para verificar se a qualidade da estrutura é adequado para a deposição.