LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

0. Procedimentos preliminares Capilar de vidro para injectáveis ​​solução. Usando um extrator capilar (Narishige, Tóquio, Japão), preparar uma pipeta afiada com uma abertura fina a partir de um tubo capilar de vidro micro (Marca GMBH, Wertheim, Alemanha). O tamanho da abertura deve ser verificada por passagem de ar através do capilar para obter borbulhante fina em água limpa. Se o capilar é fechado, então pode-se abri-lo por quebrar sua borda. Isto pode ser feito por prensagem ou arranhar o suavemente contra a água contendo paredes do tubo. Prepare o capilar tal que a abertura está quase bloqueada, mas é suficientemente aberta para permitir a formação de sub-milímetros bolhas. Limpeza de cobre disco. Sonicar os discos de cobre durante 10 min em 0,1% de Micro-90 sabão (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, EUA), depois lava-se com água duplamente destilada. Introduzir os discos em uma solução de isopropanol (técnico) e sonicar novamente durante 10 min. Barbatanaaliado, seque os discos usando ar filtrado. Esta fase de limpeza é crítico para evitar a contaminação entre IBP experimentos. De camada dupla montagem lamela. A montagem lamela foi preparada para permitir a observação da amostra sem condensação de humidade sobre a superfície do vidro de cobertura. Isto foi conseguido através da colocação de uma partícula de Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, EUA), (2 mm de diâmetro) entre duas lamelas, que foram, em seguida, colados com uma pistola de cola quente. Esta configuração impedido condensação que poderia bloquear a vista quando a amostra foi arrefecida a baixa temperatura e elimina a necessidade de soprar ar seco para a janela de observação. 1. Estágio de resfriamento Set-up Ligue a entrada do fluxo de água e de saída da fase de arrefecimento a 4 mm de diâmetro interno Tygon tubos (Saint-Gobain, Paris, França), e ligar o tubo de entrada de água do fluxo de uma bomba de água. Ligar um tubo Tygon 4 milímetros de diâmetro interno para a entrada da etapa de arrefecimento tó fornecer ar seco. O ar foi seco utilizando uma coluna de linha Drierite. Operar as bombas de ar e água. Note-se que os elementos de resfriamento não deve ser executado sem um dissipador de calor. Ligue o controlador de temperatura, câmera e rotineira LabVIEW. 2. Preparação da Amostra Colocar uma gota 3-4 ul de imersão em óleo B (laboratórios Cargille, Cedar Grove, New Jersey, EUA), no lado de trás de um disco de 7 mm de diâmetro de cobre com 500 furos perfurados uM através do disco. Posicionar o disco de cobre na fase de arrefecimento, com o lado voltado para baixo de imersão em óleo. Ligar o tubo capilar (a ponta chanfrada) para um tubo de 0,7 milímetros Tygon diâmetro interno ligada na outra extremidade a uma seringa de vidro de 2 ml (Poulten-Graf, Wertheim, Alemanha). Antes de utilizar o tubo capilar, verificar a pequena abertura do capilar de forma que a abertura é um tamanho apropriado (ver os procedimentos preliminares). Insira lentamente o glass capilar para o tubo de amostra preparada IBP proteína (2,4 uM Mp IBP-GFP em 20 mM de CaCl 2 e 25 mM Tris-HCl a pH 8, ver referência 10 para os pormenores de preparação) e puxar a seringa de vidro até que o capilar de vidro contém 0,1 ul da solução de proteína. Iniciar a gravação de vídeo através do software LabVIEW. Inserir a ponta afiada do capilar de vidro (contendo a solução de proteína) em um dos furos do disco de cobre na fase de arrefecimento. Enquanto observa através do microscópio (Olympus, Tokyo, Japan, objectiva 10x), cuidadosamente penetrar a camada de óleo de imersão com a ponta capilar de vidro, e pressionar a seringa de vidro (muito delicadamente) para entregar uma pequena quantidade (~ 10 nl) da proteína solução para criar uma gotícula uM 200. Cobrir o furo na fase de arrefecimento, com a montagem de dupla camada lamela (ver os procedimentos preliminares). 3. Medição de Actividade TH Préss botão do arrefecimento e ajustar a temperatura a -40 ° C. Inicialmente, a gota de solução será clara. A baixas temperaturas, tipicamente na gama de -30 ° C a -35 ° C, gota a muda de cor, indicando que a solução tenha sido congelada. Imediatamente após a amostra ter congelado, aumentar a temperatura lentamente até que o gelo começa a derreter a granel. Um aumento gradual da temperatura é necessária para evitar a ultrapassagem da temperatura que pode resultar na fusão completa da amostra. Mudar para um objectivo de 50x e começar a derreter o gelo, ajustando a temperatura. Este ajuste é interativo, e os passos finais são normalmente realizadas utilizando medidas de temperatura de pequenas 0,002 ° C. Continuar a fundir antes de um único cristal permanece. O tamanho final do cristal deve ser cerca de 10 um. A temperatura mais alta à qual tenha cessado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão e é determinado com precisão na fase posterior análise vídeo. <li> Ajustar a temperatura para alguns centésimos de um grau Celsius abaixo do ponto de fusão do cristal e começar uma rampa de temperatura com um atraso de 10 minutos. Ajuste a velocidade de rampa, como desejado. Durante este tempo, o cristal será exposto aos IBPS. Após a conclusão do período de exposição de 10 min, a temperatura diminui automaticamente sob o controlo de rotina de LabVIEW. Observar a forma dos cristais à medida que diminui a temperatura. Em algum momento, a súbita explosão de cristal de gelo pode ser observado. A temperatura à qual ocorre esta é conhecida como a temperatura de ruptura do cristal. Usar a análise de vídeo para determinar o ponto de fusão preciso e a temperatura de ruptura. Primeiro, por meio de análise de vídeo, encontrar o ponto de fusão precisa. Recorde-se que a mais alta temperatura a que tenha deixado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão. Documentar este ponto de fusão, em um programa de planilha. Em seguida, determinar a temperatura de ruptura precisa de cristal, e documentar este valortambém. A diferença entre o ponto de fusão e o ponto de congelação, temperatura de ruptura ou de cristal, é a actividade de histerese térmica da solução de IBP. 4. Medição da Actividade TH tempo-dependente Seguir o protocolo descrito nas Secções 3,1-3,3 para preparar um único cristal de gelo. Após a formação do cristal, ajustar o tempo de retardamento da rampa conforme desejado, e ligar a rampa. A temperatura irá diminuir a uma taxa fixa (de acordo com os requisitos dos operadores) automaticamente uma vez que o tempo de atraso de rampa passou. Documentar a temperatura a que ocorre a ruptura de cristal. Calcula-se o tempo de exposição (o tempo entre a formação de cristais e do impulso de cristal). Repita a experiência para vários tempos de atraso e representar graficamente a actividade TH como uma função do tempo de exposição para avaliar a dependência do tempo da actividade TH.