Protéines de liaison de glace (IBP), également appelées protéines antigel, inhiber la croissance de la glace et sont un additif prometteur pour une utilisation dans la cryoconservation des tissus. Le principal outil utilisé pour étudier IBP est le osmomètre nanolitre. Nous avons développé une maison conçue étape de refroidissement monté sur un microscope optique et contrôlé à l'aide d'une routine sur mesure LabVIEW. L'osmomètre nanolitre décrit ici manipulé la température de l'échantillon d'une manière ultra-sensible.
Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).
Ce travail démontre le fonctionnement d'un osmomètre nanolitre commandé par ordinateur qui permet des mesures précises de l'activité TH avec contrôle de la température extraordinaire. Dans tout système sensible à la température, les gradients de température indésirables doivent être évitées. Afin d'éviter des gradients de température dans l'appareil présenté ici, la gouttelette de solution d'essai doit être positionné au centre d'un trou dans la phase de refroidissement en cuivre disque (étape 2,7). En outre, le cristal unique devrait être au centre de la goutte plutôt que près des bords (dans la plupart des cas, cela se produira spontanément). La dépendance temporelle décrite indique que la vitesse de refroidissement peuvent influencer les lectures TH. Ainsi, on propose notamment un rapport de la durée pendant laquelle le cristal a été exposée à la solution avant le refroidissement, ainsi que la vitesse de refroidissement. En général, nous a attendu 10 minutes avant de la décélération de la température de 0,01 ° C chaque étapes 4 sec.
Les co-contrôlées LabVIEWOling étape a été adapté pour être utilisé avec un microscope inversé sur lequel des dispositifs microfluidiques peuvent être manipulés thermiquement. Ce système facilite la réalisation d'expériences d'échange de solutions impliquant des cristaux de glace et IBPS taggés avec eGFP 9, 10, 16. Le système à commande LabVIEW peut être adapté à un stade Clifton en connectant le contrôleur de température 3040 par l'intermédiaire d'un circuit électrique désigné adaptation. Un tel système est utilisé dans le laboratoire Davies 17. Le logiciel LabVIEW et l'adaptation désigné conception de circuit électrique pour la phase de Clifton sont disponibles sur demande.
En conclusion, nous décrivons un osmomètre nanolitre qui facilite le contrôle et la manipulation sensible de la température et le taux d'augmentation de la température et une diminution (avec 0,002 ° C de sensibilité), en coordination avec une interface vidéo à travers une routine LabVIEW pour analyse en temps réel. Ce système peut effectuer reproductibles taux contrôlées par des expériences qui sont important pour enquêter sur la cinétique des interactions IBP avec de la glace. De telles expériences peuvent répondre à plusieurs questions débattues à long entourant le mécanisme d'action de IBP.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par l'ISF, la NSF, et l'ERC. Nous tenons à souligner l'aide technique avec le niveau de température de Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, et Jeremy Dennison. Assistance au développement de logiciels ont été fournis par Ou Chen, Xu Di, Rajesh Sannareddy, et Sumit Bhattachary. Nous tenons à remercier nos collaborateurs Prof Peter L. Davies et Dr Laurie A. Graham pour la protéine de fusion IBP et des discussions utiles. Nous remercions également les membres de laboratoire Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, le Dr Yeliz Celik, le Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, et Guy Shlomit pour leur rétroaction des utilisateurs.
Name | Company | Catalog Number/model | Comments |
Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
Micro 90 cleaning solution | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |