ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة
Summary
البروتينات ملزمة الجليد (IBPs)، المعروف أيضا باسم البروتينات التجمد، وتمنع نمو الجليد واعدة هي المضافة لاستخدامها في الحفظ بالتبريد من الأنسجة. الأداة الرئيسية المستخدمة لتحقيق IBPs هو مقياس التناضح نانولتر. وضعنا منزل التصميم مرحلة التبريد التي شنت على المجهر الضوئي والتحكم باستخدام روتين ابفيف مبنية خصيصا. وصف مقياس التناضح نانولتر هنا التلاعب درجة حرارة العينة بطريقة فائقة الحساسية.
Abstract
Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا العمل يدل على تشغيل مقياس التناضح نانولتر الكمبيوتر التي تسيطر عليها تمكن قياسات دقيقة من النشاط TH مع التحكم في درجة الحرارة غير عادية. في أي نظام حساسة للحرارة، لا بد من تجنب التدرجات درجة الحرارة غير المرغوب فيها. لتجنب درجات الحرارة التدرجات في الجهاز المعروضة هنا، لا بد من وضع حل لقطيرة الاختبار في وسط حفرة في مرحلة التبريد النحاس القرص (الخطوة 2.7). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون واحدة الكريستال في وسط قطرات بدلا من قرب حواف (في معظم الحالات، وهذا لن يحدث تلقائيا). الاعتماد الوقت وصف يشير إلى أن معدل التبريد قد تؤثر على قراءات TH. وهكذا، فإننا نقترح بما في ذلك تقرير الزمنية التي تعرضت لها الكريستال في حل قبل التبريد، وكذلك معدل التبريد. انتظرنا عادة 10 دقيقة قبل التعلية بانخفاض درجة الحرارة عند 0.01 ° C الخطوات في كل ثانية 4.
المشارك ابفيف التي تسيطر عليهاوقد تم تكييف المرحلة أولينغ للاستخدام مع مجهر مقلوب على الأجهزة التي يمكن التلاعب بها ميكروفلويديك حراريا. هذا النظام يسهل أداء التجارب التي تنطوي على تبادل حل بلورات الثلج وIBPs ذات الكلمات الدلالية مع EGFP 9 و 10 و 16. ويمكن تكييف نظام ابفيف التي تسيطر عليها إلى مرحلة كليفتون من خلال ربط تحكم في درجة الحرارة عن طريق الدائرة 3040 عين الكهربائية التكيف. ويتم تشغيل هذا النظام في المختبر ديفيز 17. البرنامج ابفيف والتكيف المعينة تصميم الدوائر الكهربائية للمرحلة كليفتون متاحة عند الطلب.
وفي الختام، فإننا وصف مقياس التناضح نانولتر تسهل السيطرة الحساسة والتلاعب في درجة الحرارة ومعدل ارتفاع درجة الحرارة وانخفاض (مع حساسية 0،002 C °)، بتنسيق مع واجهة الفيديو من خلال روتين ابفيف في الوقت الحقيقي التحليل. يمكن هذا النظام أداء استنساخه معدل تسيطر التجارب التي مهمر عن التحقيق في حركية التفاعلات IBP مع الجليد. يمكن معالجة العديد من هذه التجارب الطويلة من الجدل القضايا المحيطة آلية عمل IBPs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل قوى الأمن الداخلي، NSF، وERC. نود أن نعترف مساعدة فنية مع المرحلة درجات الحرارة من ميلفورد راندي، كورين مايكل شيفر دوغ، وجيريمي دينيسون. وقدمت المساعدة مع تطوير البرمجيات من قبل تشن أو شو دي، Sannareddy راجيش، وBhattachary سوميت. نود أن نشكر لدينا المتعاونين البروفيسور بيتر ديفيس والدكتور L. لوري غراهام A. للبروتين IBP النائب والمناقشات مفيدة. نشكر أيضا أعضاء المختبر الدكتورة مايا بار دوليف، Yangzhong تشين الدكتور سيليك Yeliz الدكتور Pertaya ناتاليا، Mizrahy Ortal، وغاي شلوميت لردود الفعل المستخدم الخاصة بهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number/model | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis “antifreeze” protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization – an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
