Summary

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Published: December 04, 2012
doi:

Summary

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Abstract

Hücresel motilite tek hücreli ve çok hücreli canlılar için önemli bir biyolojik süreçtir. Bu besinlerin veya uzak uygun koşulların yanı sıra doku gelişimi, bağışıklık gözetim ve yara iyileşmesi için çok hücreli organizmalarda olduğu gibi, sadece birkaç rolleri 1,2,3 söz kaynağı doğru tek hücreli organizmaların hareketi için gereklidir. Bu işlemin önemli Deregülasyon, nörolojik kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların yanı sıra, şiddetlenir tümör oluşumuna yol açan ve 4,5 yayılabilir. Moleküler, aktin polimerizasyonu ve reseptör geri dönüşüm hücre 6,7,8 öne hareketini götürmek hücresel uzantıları (lamellipodia), yaratmada önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Ancak, hücre göçü ile ilgili birçok biyolojik sorular yanıtsız kalıyor.

Insan sağlığı ve hastalık hücresel hareketlilik açısından merkezi bir rol özgü mec anlamanın önemini vurgularhanisms bu süreç içinde yer alan ve özellikle önemli hücre hareketi değerlendirilmesi için doğru yöntem sağlar. Mikroskop genellikle hücre hareketi görselleştirmek için kullanılır. Ancak, hücre hareketli hücrelerin nicel zaman lapsed filmleri oluşturmak için pahalı kameralar ve yazılım gerektiren bir kaynak-alıcı bir süreç hücre göçü kantitatif ölçümü yapmak, oldukça yavaş hareket ettirin. Bu nedenle, maliyet-etkin olmayan zahmetli ve bu ortak laboratuvar ekipmanı kullanan bir hücre göçü bir kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için yeteneği birçok araştırmacı için büyük bir ihtiyaçtır.

Phagokinetic parça motilite tayini kolloidal altın kaplamalı cam lamel 9,10 ölçülebilir bir parça oluşturmak için onun yolundan altın parçacıkları temizlemek için hareketli bir hücre yeteneğini kullanır. Serbestçe kullanılabilir yazılım kullanımı ile, birden fazla parçayı istatistiksel gereksinimleri gerçekleştirmek için her tedavi için değerlendirilebilir. Tahlil değerlendirmek için kullanılabilecekBu tür kanser hücrelerinin 11,12, fibroblastlar 9, nötrofiller 13, iskelet kas hücreleri 14, keratinositler 15, trofoblastlar 16, endotel hücreleri 17 ve monositler 10,18-22 gibi birçok hücre tipleri, motilitesi. Protokol sodyum sitrat ile chloroauric asit (Au 3 +) bir azalma ile oluşturulan nanoparçacıkların (Au °) ile kaplanmış slaytlara oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 1951, 23. Turkevich ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sonra Frens ve diğerleri tarafından 1970 de geliştirilmiştir. 24,25. Bu kimyasal indirgeme aşamasının bir sonucu olarak, altın parçacıkları (çap: 10-20 nm), tepkime karışımından, çökelti ve hücre göçü analiz 9,26,27 kullanıma hazır sonra cam lameller üzerine tatbik edilebilir.

Genel olarak, phagokinetic parça motilite hücresel tahlil motilite hızlı, basit ve kantitatif ölçüsüdür. Buna ek olarak,Zaman lapsed görüntüleme, hem de, araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak başka kullanım için müsait olmayan hücre tipleri ile birlikte kullanım için, basit bir yüksek hacimli tahlil olarak kullanılabilir. Birlikte, kantitatif pahalı mikroskoplar ve yazılıma gerek olmadan birden fazla hücre tipleri hücresel motilite ölçme yeteneği, ortak laboratuvar ekipman ve kimyasalların kullanımı ile birlikte, hücresel anlamada phagokinetic parça motilite tayini ile ilgilenen bilim adamları için sağlam bir seçim yapmak motilite.

Protocol

1. Jelatin-kaplanmış lameller hazırlanması Bir steril plastik 100 mm çanak (es) yerleştirin asitle yıkanmış cam lameller (çapı 15 mm). Tabak başına 8-9 lamelleri yerleştirin ve birbirlerine dokunmadan veya yemeğin tarafında değil emin olun .. Not: lameller, iğneler ve cımbız muhtemel kirletici mikroorganizmaların, hem de hareketliliği de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonlar, endotoksinler etkiler ortadan kaldırmak için steril olm…

Representative Results

Gösterilen tek bir hücre (bizim deneyler bir monosit Şekil 2 'de gösterilmiştir) tarafından temizlenir bir izi alanı gösteren bir ışık mikroskobu altında alınan resimlerin bir örnektir. Non-motil hücrelerin karakteristik küçük, oval veya bu uyarılmamış hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için hareket düşük bazal seviyesini gösteren kendi etrafında daire şeklinde yolları oluşturmak. Bunun aksine, yüksek derecede hareketli hücreler [Sistemimiz…

Discussion

Bu makalede sunulan phagokinetic parça motilite tayini hücre göçü kantitatif analiz için basit ve son derece etkili bir yöntemdir. Birden fazla hücre tipleri 9-17 analiz edilebilir, çünkü bu yöntem farklı disiplinlerde potansiyeline geniş bir kullanıma sahiptir. Koloidal altın kaplı cam lameller kullanımı, bir hareket eden bir hücre ile temizlenmiş bir izi alanı ölçümü sağlar. Test hücresi motilitesi üzerine (ECM ligandlar, virüsler, bakteriler saflaştırılmış yani b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI050677, HD-051998 ve GM103433), bir Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (10PRE4200007) hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Glass Coverslips (15 mm) Fisher Scientific 12-545-83  
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890  
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802  
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29  
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84  
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001  
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15  
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200  
200 ml Barrier Tips CLP BT200  
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/   License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon   Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
      Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Play Video

Cite This Article
Nogalski, M. T., Chan, G. C., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

View Video