Summary

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Published: December 04, 2012
doi:

Summary

Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

Abstract

Motilità cellulare è un processo biologico importante per entrambi gli organismi unicellulari e pluricellulari. È essenziale per il movimento di organismi unicellulari verso una fonte di nutrienti o lontano da condizioni inadatte, nonché negli organismi multicellulari per lo sviluppo del tessuto, sorveglianza immunitaria e guarigione delle ferite, solo per citarne alcuni ruoli 1,2,3. La deregolamentazione di questo processo può portare a gravi malattie neurologiche, cardiovascolari e immunologiche, così come aggravato la formazione di tumori e diffondere 4,5. Molecolarmente, polimerizzazione di actina e riciclaggio recettore hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella creazione di estensioni cellulari (lamellipodia), che guidano il movimento in avanti della cella 6,7,8. Tuttavia, molte domande circa la migrazione delle cellule biologiche rimangono senza risposta.

Il ruolo centrale per la motilità cellulare in salute e malattia sottolinea l'importanza di comprendere il mec specificohanisms coinvolti in questo processo e rende metodi accurati per valutare la motilità cellulare particolarmente importante. Microscopi sono di solito utilizzati per visualizzare il movimento delle cellule. Tuttavia, le cellule muovono piuttosto lentamente, rendendo la misurazione quantitativa della migrazione delle cellule un processo di consumo di risorse che richiedono costose telecamere e software per creare quantitativi e ritardi film di cellule mobili. Pertanto, la capacità di eseguire una misurazione quantitativa della migrazione cellulare che è conveniente, non laborioso, e che utilizza attrezzature comuni laboratorio è una grande necessità di molti ricercatori.

Il dosaggio phagokinetic motilità traccia utilizza la capacità di una cellula in movimento per eliminare particelle d'oro dal suo percorso per creare una traccia misurabile su una colloidale oro rivestite coprioggetto 9,10. Con l'uso di software liberamente disponibile, tracce multiple possono essere valutati per ogni trattamento di compiere esigenze statistiche. Il saggio può essere utilizzato per valutaremotilità di molti tipi di cellule, come le cellule tumorali 11,12, fibroblasti 9 13, neutrofili, cellule muscolari scheletriche, cheratinociti 14 15, 16 trofoblasto, cellule endoteliali e monociti 17, 10,18-22. Il protocollo prevede la creazione di vetrini rivestiti con nanoparticelle di oro (Au °) che sono generati da una riduzione di acido chloroauric (Au 3 +) con citrato di sodio. Questo metodo è stato sviluppato da Turkevich et al. Nel 1951 23 e poi migliorata nel 1970 da Frens et al. 24,25. Come risultato di questa fase la riduzione chimica, particelle di oro (10-20 nm di diametro) precipitare dalla miscela di reazione e può essere applicato a vetrini, che sono quindi pronto per l'uso nelle analisi migrazione cellulare 9,26,27.

In generale, il dosaggio phagokinetic motilità traccia è una misura veloce, facile e quantitativa della motilità cellulare. Inoltre,può essere utilizzato come un semplice saggio ad alta prestazione, per l'uso con i tipi di cellule che non sono suscettibili di e ritardi imaging, nonché altri usi a seconda delle esigenze del ricercatore. Insieme, la capacità di misurare quantitativamente la motilità cellulare di tipi di cellule senza la necessità di costosi microscopi e software, insieme con l'uso di attrezzature di laboratorio e prodotti chimici comuni, rendono il phagokinetic motilità saggio traccia una scelta solida per gli scienziati con un interesse a comprendere cellulare motilità.

Protocol

1. Preparazione di gelatina rivestite coprioggetto Posto lavata con acido coprioggetto (15 mm di diametro) in un piatto di plastica sterile 100 mm (es). Mettere 8-9 coprioggetti per piatto e fare in modo che non si tocchino tra loro o ai lati del piatto .. Nota: Coprivetrini, aghi e pinzette devono essere sterili per eliminare eventuali microrganismi contaminanti, nonché endotossine che influenzano le funzioni cellulari, compresa la motilità. <ol start…

Representative Results

Viene mostrato un esempio di immagini prese al microscopio ottico mostra un'area traccia cancellata da una singola cellula (un monocita dai nostri esperimenti è mostrato in Figura 2). Non mobili cellule creano caratteristica piccola, ovale o di forma circolare intorno si tratti indicanti un basso livello basale di movimento per queste cellule non stimolate (Figure 2A e 2B). In contrasto, cellule altamente motili [nel nostro sistema, citomegalovirus umano (HCMV) cellule infettate] s…

Discussion

Il saggio di motilità phagokinetic brano presentato in questo articolo è un metodo semplice e molto efficace per l'analisi quantitativa della migrazione cellulare. Perché più tipi di cellule possono essere analizzati 9-17, questo metodo ha il potenziale utilizzo ampio diverse discipline. L'uso di oro colloidale rivestite coprioggetto consente la misurazione di una zona traccia cancellata da una cellula in movimento. Il dosaggio può misurare l'effetto di stimoli differenti fattori di crescita …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, e GM103433), un Malcolm Feist cardiovascolare ricerca borsa di studio, e un americano comunione Heart Association predoctoral (10PRE4200007).

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Glass Coverslips (15 mm) Fisher Scientific 12-545-83  
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890  
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802  
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29  
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84  
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001  
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15  
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200  
200 ml Barrier Tips CLP BT200  
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/   License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon   Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
      Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

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Nogalski, M. T., Chan, G. C., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

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