Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.
תנועתיות ניידות היא תהליך ביולוגי חשוב לשני יצורים חד תאיים ורבים תאיים. הוא חיוני לתנועה של יצורים חד תאיים לכיוון מקור של חומרים מזינים או במרחק שאינם מתאימים תנאים, כמו גם באורגניזמים תאיים לפיתוח רקמות, מעקב חיסוני וריפוי פצעים, רק כדי להזכיר כמה תפקידים 1,2,3. הסרת פיקוח על תהליך זה יכול להוביל למחלות קשות נוירולוגיות, לב וכלי דם ומערכת חיסון, כמו גם היווצרות גידול החמיר והתפשטה 4,5. מולקולרי, פילמור יקטין ומחזור הקולט הוכחו לשחק תפקיד חשוב ביצירת רחבות סלולריות (lamellipodia), המניעות את התנועה קדימה בתא 6,7,8. עם זאת, שאלות רבות ביולוגיות על נדידת תאים נותרו ללא מענה.
התפקיד המרכזי לתנועתיות סלולרית באדם מחל בריאות מדגיש את החשיבות של הבנת MEC הספציפיhanisms מעורב בתהליך הזה והופך את השיטות מדויקות להערכת תנועתיות תא חשובה במיוחד. מיקרוסקופים משמשים בדרך כלל כדי לחזות את התנועה של תאים. עם זאת, תאים לנוע די לאט, מה שהופך את מדידת כמותית של נדידת תאי תהליך גוזל משאבים דורשים מצלמות ותוכנה יקרות כדי ליצור סרטים כמותיים נושנים של תאים ניעתי. לכן, היכולת לבצע מדידת כמותית של נדידת תאים שהיא יעיל וחסכוני, שאינם מייגע, ושמנצל ציוד מעבדה משותף היא צורך גדול עבור חוקרים רבים.
בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic מנצלת את יכולתו של תא נע כדי לנקות חלקיקי זהב ממסלולו כדי ליצור מסלול מדיד על coverslip זכוכית מצופת הזהב colloidal 9,10. עם השימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, מספר רבים של מסלולים ניתן להעריך עבור כל טיפול כדי להשיג את הצורכים סטטיסטיים. הבדיקה יכולה להיות מנוצלת כדי להעריךתנועתיות של תאים מסוגים רבים, כגון תאים סרטניים, 11,12 פיברובלסטים 9, נויטרופילים 13, תאי שריר שלד 14, 15, הקרטינוציטים trophoblasts 16, 17, תאי האנדותל ומונוציטים 10,18-22. הפרוטוקול כולל יצירת שקופיות מצופות בחלקיקי זהב (° Au) המופקים על ידי הפחתה של חומצת chloroauric (3 Au +) על ידי ציטרט הנתרן. שיטה זו פותחה על ידי Turkevich et al. בשנת 1951 23 ולאחר מכן השתפרה בשנתי ה -1970 על ידי Frens et al. 24,25. כתוצאה מהפחתת צעד זה כימי, חלקיקי זהב (10-20 ננומטר בקוטר) יזרזו מתערובת התגובה ויכולים להיות מיושמים על coverslips זכוכית, אשר אז מוכנים לשימוש בניתוחי נדידה סלולריות 9,26,27.
באופן כללי, בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic היא מדד מהיר, כמותית וקלה של תנועתיות סלולרית. בנוסף,יכול להיות מנוצל כמו assay פשוט תפוקה גבוהה, לשימוש עם סוגי תאים שאינם ניתן להדמיה נושנה, כמו גם שימושים אחרים, בהתאם לצרכימים של החוקר. ביחד, את היכולת למדידת כמותית תנועתיות סלולריות של סוגי תאים מרובים ללא צורך במיקרוסקופים ותוכנה יקרים, יחד עם השימוש בציוד מעבדה משותף וכימיקלים, לבצע בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic בחירה מוצקה למדענים בעלי עניין בהבנה סלולרית תנועתיות.
בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic הוצגה במאמר זה היא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לניתוח כמותי של נדידת תאים. כי ניתן לנתח סוגי תאים מרובים 9-17, לשיטה זו יש שימוש הרחב הפוטנציאל על פני תחומים רבים. השימוש בcoverslips הזכוכית מצופית זהב colloidal מאפשר מדידה של אזור מסלול המסומן על י?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AI050677, HD-051998, וGM103433), מלקולם פייסט לב וכלי דם מחקר מלגה, ומלגת איגוד לב אמריקנית predoctoral (10PRE4200007).
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Glass Coverslips (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. |