Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay
Summary
Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.
Abstract
Cellular Motilität ist ein wichtiger biologischer Prozess für beide einzelligen und mehrzelligen Organismen. Es ist wichtig für die Bewegung der einzelligen Organismen zu einer Quelle von Nährstoffen oder weg von ungeeigneten Bedingungen, als auch in vielzelligen Organismen für Tissue Entwicklung, Immunüberwachung und Wundheilung, nur um ein paar Rollen 1,2,3 erwähnen. Deregulierung dieses Prozesses kann zu schweren neurologischen, Herz-Kreislauf-und immunologischen Erkrankungen, sowie verschärfte Tumorbildung führen und zu verbreiten 4,5. Molekular sind Aktin-Polymerisation und Rezeptor-Recycling erwiesen wichtige Rollen bei der Schaffung zellulären Verlängerungen (Lamellipodien), die die Vorwärtsbewegung der Zelle 6,7,8 anzutreiben spielen. Allerdings bleiben viele biologische Fragen zu Zellmigration unbeantwortet.
Die zentrale Rolle für die zelluläre Motilität menschlicher Gesundheit und Erkrankungen unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der spezifischen mechanisms an diesem Prozess beteiligt und macht genaue Methoden zur Bewertung Zellmotilität besonders wichtig. Mikroskope werden üblicherweise verwendet, um die Bewegung von Zellen visualisieren. Allerdings bewegen Zellen eher langsam, so dass die quantitative Messung der Zellmigration eine Ressource langwieriger Prozess erfordern teure Kameras und Software, um quantitative Zeitraffer Filme von beweglichen Zellen zu schaffen. Daher ist die Fähigkeit, eine quantitative Messung der Zellmigration, die kostengünstige, nicht mühsam, und daß nutzt gemeinsamen Laborgeräten ist ausführen ein großer Bedarf für viele Forscher.
Die Spur phagokinetic Motilität Assay nutzt die Fähigkeit einer Zelle zu bewegenden Goldpartikel aus seiner Bahn zu löschen, um eine Spur auf einer messbaren kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen 9,10 erstellen. Mit dem Einsatz von frei verfügbarer Software, können mehrere Spuren für jede Behandlung, die statistischen Anforderungen erfüllen ausgewertet werden. Der Assay kann verwendet werden, um zu beurteilenMotilität von vielen Zelltypen, wie Krebszellen 11,12, Fibroblasten 9, Neutrophilen 13, Skelettmuskelzellen 14, Keratinozyten 15, Trophoblasten 16, 17 Endothelzellen und Monozyten 10,18-22. Das Protokoll beinhaltet die Erzeugung von Folien mit Gold-Nanopartikeln (Au °), die durch eine Reduktion von Chlorgoldsäure (Au 3 +) durch Natriumcitrat erzeugt beschichtet sind. Diese Methode wurde von Turkevich et al. Im Jahr 1951 23 und dann verbesserte sich in den 1970er Jahren von Frens et al. 24,25. Als Ergebnis dieser chemischen Reduktionsschritt auszufällen Goldpartikel (10 bis 20 nm Durchmesser) aus der Reaktionsmischung und kann auf Deckgläschen, die dann bereit für die Verwendung in Zellwanderung Analysen 9,26,27 aufgebracht werden.
Im Allgemeinen ist die Spur phagokinetic Motilität Assay eine schnelle, quantitative und einfache Maßnahme zellulärer Motilität. Darüber hinaus ist eskann als einfache Hochdurchsatz-Assay verwendet werden, zur Verwendung mit Zelltypen, die nicht zugänglich sind Zeitraffer Bildgebung, sowie andere Anwendungen in Abhängigkeit von den Bedürfnissen der Forscher. Zusammen, die Fähigkeit, quantitativ zu messen zellulären Motilität von mehreren Zelltypen, ohne die Notwendigkeit für teure Mikroskope und Software, zusammen mit der Verwendung von gemeinsamen Laborgeräte und Chemikalien machen den phagokinetic Spur Motilität Assay eine gute Wahl für die Wissenschaftler mit einem Interesse für das Verständnis zellulärer Motilität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die phagokinetic Spur Motilität Assay in diesem Artikel vorgestellt ist eine einfache und sehr effektive Methode zur quantitativen Analyse von Zellmigration. Da mehrere Zelltypen 9-17 analysiert werden kann, hat diese Methode das Potenzial breiten Einsatz über mehrere Disziplinen. Die Verwendung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erlaubt die Messung einer Gleisbereich durch einen sich bewegenden Zelle gelöscht. Der Assay kann den Effekt verschiedener Stimuli (zB Wachstumsfaktoren, Lig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AI050677, HD-051.998 und GM103433), ein Malcolm Feist Herz-Kreislauf-Forschungsstipendium und ein American Heart Association Promotionsstipendium (10PRE4200007) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Glass Coverslips (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. |
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