Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

O embrionário da crista neural (NC) é uma população de células progenitoras multipotentes que origina na face dorsal do tubo neural, sofre uma transição epitelial para mesenquimal (TEM) e migra ao longo do embrião, dando origem a diversos tipos celulares ^1-3. NC também tem a capacidade única de influenciar a diferenciação e maturação de órgãos-alvo ^4-6. Quando explantado in vitro, células progenitoras de NC submetidos a auto-renovação, migrar e diferenciam-se em uma variedade de tipos de tecidos incluindo neurónios, células gliais, células musculares lisas, cartilagem e do osso.

Multipotency de NC foi descrita pela primeira vez a partir de explantes do tubo neural aviária ^7-9. Em isolamento in vitro de células de NC facilita o estudo de NC dinâmica, incluindo a proliferação, migração e multipotency. Trabalho adicional nos sistemas de aves e de rato demonstraram que as células explantadas NC NC reter o seu potencial quando transplantadas de volta para o embrião ¹⁰-13. Como essas propriedades inerentes celulares são preservadas em progenitores explantadas NF, o ensaio de explante tubo neural fornece uma opção atrativa para o estudo da NC in vitro.

Para alcançar uma melhor compreensão da NC mamíferos, muitos métodos têm sido utilizados para isolar populações NC. NC-derivados progenitores podem ser cultivadas a partir de pós-migratórias locais em ambos o embrião e adulto para estudar a dinâmica dos progenitores pós-migratórias NC ^11,14-20, no entanto isolamento de células progenitoras de NC como eles emigram a partir do tubo neural fornece preservação óptima de NC célula potencial e propriedades migratórias ^13,21,22. Alguns protocolos empregar separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar uma população enriquecida para NC progenitores particulares ^11,13,14,17. No entanto, quando se inicia com embriões na fase inicial, os números de células adequadas para as análises são difíceis de obter com FACS, complicando o isolamento de início NC populations a partir de embriões individuais. Aqui, descrevemos uma abordagem que não depende de FACS e resultados em uma população de aproximadamente 96% NC puro com base em uma Wnt1-Cre repórter linhagem ativado ^23.

O método aqui apresentado é uma adaptação de protocolos otimizados para a cultura do rato NC ^11,13. As vantagens deste protocolo, em relação aos métodos anteriores são de que 1) as células não são cultivadas em uma camada alimentadora, 2) FACS não é necessário para obter uma população relativamente puro NC, 3) células premigratory NF são isolados e 4) os resultados são facilmente quantificado. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de NC a partir de qualquer modelo de rato mutante, facilitando o estudo das características NF com diferentes manipulações genéticas. A limitação desta abordagem é que o NF é removido a partir do contexto do embrião, o que é conhecido para influenciar a sobrevivência, a migração ea diferenciação do NC ^2,24-28.