العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران
Summary
العزلة من قمة العصبية الجنينية من الأنبوب العصبي يسهل استخدام<em> في المختبر</em> طرق لدراسة الهجرة، وتجديد الذات، وmultipotency من قمة العصبية.
Abstract
والجنينية العرف العصبي (NC) هو عدد السكان سلف multipotent الذي ينشأ في الجانب الظهري في الأنبوب العصبي، يخضع 1 الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وتنتقل في مختلف أنحاء جنين، مما أدى إلى مختلف أنواع الخلايا 1-3. NC أيضا لديه قدرة فريدة على التأثير على التمايز والنضج من الأعضاء المستهدفة 4-6. عندما explanted في المختبر، الأسلاف NC الخضوع الذاتي تجديد، والهجرة تفرق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة بما في ذلك الخلايا العصبية، والدبق، وخلايا العضلات الملساء، والغضاريف والعظام.
وكان أول وصف NC multipotency من explants من الأنبوب العصبي الطيور 7-9. في عزلة في المختبر من خلايا NC يسهل دراسة ديناميات NC بما في ذلك انتشار الأسلحة النووية، والهجرة، وmultipotency. مزيد من العمل في أنظمة الطيور والفئران أظهرت أن الخلايا explanted NC الاحتفاظ إمكاناتهم NC عندما زرعها مرة أخرى في جنين 10-13. لأن الحفاظ على هذه الخصائص الكامنة الخلوية في الأسلاف NC explanted، ويزدرع الأنبوب العصبي فحص يوفر خيارا جذابا لدراسة نورث كارولاينا في المختبر.
من أجل التوصل إلى فهم أفضل للNC الثدييات، وقد استخدمت العديد من الأساليب لعزل سكان نورث كارولاينا. يمكن زرعها NC المستمدة من الأسلاف من ما بعد الهجرة مواقع في كل من جنين وتعليم الكبار لدراسة ديناميات الأسلاف نورث كارولاينا في مرحلة ما بعد الهجرة 11،14-20، ولكن بمعزل عن الأسلاف نورث كارولاينا حيث يهاجر من الأنبوب العصبي يوفر الحفاظ الأمثل لل NC الخلية المحتملة، والخصائص الكثيرة 13،21،22. بعض البروتوكولات توظيف مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) لعزل السكان NC المخصب لأسلاف خاصة 11،13،14،17. ومع ذلك، عندما تبدأ الأجنة مرحلة مبكرة، وأرقام الخلية كافية لتحليل ويصعب الحصول على مع نظام مراقبة الأصول الميدانية، مما يعقد من عزلة populatio نورث كارولاينا في وقت مبكرنانوثانية من أجنة الفردية. هنا، نحن تصف النهج الذي لا يعتمد على نظام مراقبة الأصول الميدانية والنتائج في عدد السكان ما يقرب من 96٪ NC محض على أساس مراسل Wnt1، لجنة المساواة العرقية نسب المنشط 23.
ويتم تكييف الطريقة المعروضة هنا من البروتوكولات الأمثل لثقافة NC الفئران 11،13. من مزايا هذا البروتوكول بالمقارنة مع الطرق السابقة هي أن 1) لا نمت الخلايا على طبقة التغذية، 2) نظام مراقبة الأصول الميدانية ليست مطلوبة للحصول على سكان NC نقي نسبيا، 3) يتم عزل الخلايا premigratory NC و 4) النتائج بسهولة كميا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل NC من أي نموذج الفأر الطافر، وتسهيل دراسة الخصائص NC مع التلاعب الجيني مختلفة. الحد من هذا النهج هو أن تتم إزالة NC من سياق جنين، والذي يعرف للتأثير على البقاء على قيد الحياة، والهجرة، والتمايز في نورث كارولاينا 2،24-28.
Protocol
Discussion
وينبغي إيلاء الاهتمام الدقيق لمرحلة التطوير من الجنين لضمان نجاح هذا النهج. عد somites من أجنة الفئران في وقت مبكر أمر بالغ الأهمية سواء بالنسبة للمرحلة مطابقة الأجنة داخل القمامة وتحديد المناطق الصحيح من الأنبوب العصبي للعزلة. وهناك تباين في واحد أو اثنين somites بين الأج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف مارك زنياك للحصول على المساعدة فيديو. ونود أيضا أن نعترف شون موريسون في جنوب غرب التحرير للبروتوكول الأصلي لزراعة خلايا الفئران نورث كارولاينا. وأيد هذا العمل فاندربيلت المركز الطبي لجامعة لدعم البرنامج الأكاديمي، وكان من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HD36720 وHD036720-11S109) و11GRNT7690040 AHA على بال، والزمالات predoctoral من AHA (0615209B)، والمعاهد الوطنية للصحة (NS065604) لحركة عدم الانحياز، وتخطيط موارد المؤسسات بدعم من T32HD007502 تدريب منحة المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
| Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
| Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |
References
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. . The neural crest. , (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -. P. . Neural crest induction and differentiation. , (2006).
- Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
- Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
- Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
- Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
- Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
- Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
- White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
- Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
- Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
- Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. , 126-3781 (1999).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
- Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
- Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
- Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
- Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
- Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
- Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
