Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale
Summary
Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso di<em> In vitro</em> Metodi per lo studio della migrazione, self-renewal, e multipotenza di cresta neurale.
Abstract
Il embrionale cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule progenitrici multipotenti che si origina nel lato dorsale del tubo neurale, subisce un epitelio di transizione mesenchimale (EMT) e migra in tutta l'embrione, dando luogo a diversi tipi di cellule 1-3. NC ha anche la capacità unica di influenzare la differenziazione e la maturazione degli organi bersaglio 4-6. Quando espiantato in vitro, progenitori NC sottoposti a self-renewal, migrare e differenziarsi in una varietà di tipi di tessuto compresi i neuroni, glia, cellule muscolari lisce, cartilagine e osso.
Multipotenza NC è stata descritta da espianti del tubo neurale aviaria 7-9. In isolamento in vitro di cellule NC facilita lo studio delle dinamiche NC, compresa la proliferazione, la migrazione e multipotenza. Ulteriori attività nei sistemi di aviaria e nel ratto hanno dimostrato che le cellule espiantati NC mantengono il loro potenziale NC, quando trapiantati in embrione 10-13. Poiché queste proprietà intrinseche cellulari sono conservati in espiantati progenitori NC, il saggio di espianto del tubo neurale fornisce un'opzione interessante per lo studio della NC in vitro.
Per ottenere una migliore comprensione del mammifero NC, molti metodi sono stati impiegati per isolare popolazioni NC. NC-derivati progenitori può essere coltivato da posizioni post-migratori, sia l'embrione e adulti per studiare la dinamica di post-migratori progenitori NC 11,14-20, tuttavia l'isolamento di cellule progenitrici NC in quanto emigrano dal tubo neurale fornisce la migliore conservazione dei NC potenzialità e le proprietà delle cellule migratorie 13,21,22. Alcuni protocolli impiegano fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) per isolare una popolazione NC arricchito per progenitori particolari 11,13,14,17. Tuttavia, quando a partire da embrioni in fase iniziale, il numero di cellule sufficienti per le analisi sono difficili da ottenere con FACS, complicando l'isolamento dei primi NC populations da embrioni individuali. Qui, descriviamo un approccio che non si basa su FACS ed i risultati in una popolazione di circa il 96% NC puro basato su un Wnt1 Cre-giornalista attivato lignaggio 23.
Il metodo presentato qui è l'adattamento di protocolli ottimizzati per la cultura di ratto NC 11,13. I vantaggi di questo protocollo rispetto ai precedenti metodi che sono 1) le cellule non sono cresciute su uno strato alimentatore, 2) FACS non è necessaria per ottenere una popolazione relativamente puro NC, 3) NC premigratory cellule vengono isolate e 4) risultati sono facilmente quantificato. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per l'isolamento di NC da qualsiasi modello di topo mutante, facilitando lo studio delle caratteristiche NC con diverse manipolazioni genetiche. Il limite di questo approccio è che il NC viene rimosso dal contesto dell'embrione, che è noto per influenzare la, migrazione sopravvivenza e la differenziazione del NC 2,24-28.
Protocol
Discussion
Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla fase di sviluppo dell'embrione per assicurare il successo di questo approccio. Contando somiti di embrioni di topo primi è fondamentale sia per la fase di adattamento embrioni all'interno di una cucciolata e la determinazione delle regioni corrette di tubo neurale per l'isolamento. Una variazione di uno o due somiti tra embrioni è entro una gamma ragionevole di temporizzazione di sviluppo, a seconda della risoluzione dell'esperimento condotto. Un emb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Marc Wozniak per l'assistenza video. Vorremmo inoltre ringraziare Sean Morrison del Southwestern per il protocollo originale per la coltura di cellule di ratto NC. Questo lavoro è stato supportato Vanderbilt University Medical Support programma Academic Center e da sovvenzioni da parte del NIH (HD36720 e HD036720-11S109) e il 11GRNT7690040 AHA a PAL, borse predoctoral della AHA (0615209B) e NIH (NS065604) a NAM, e ERP è stato sostenuta da una sovvenzione del NIH di formazione T32HD007502.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
| Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
| Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |
References
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. . The neural crest. , (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -. P. . Neural crest induction and differentiation. , (2006).
- Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
- Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
- Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
- Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
- Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
- Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
- White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
- Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
- Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
- Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. , 126-3781 (1999).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
- Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
- Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
- Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
- Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
- Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
- Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
