Summary

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Published: August 01, 2012
doi:

Summary

מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה מקרופאגים<em> In vivo</em>, הנובעת מקרופאגים מקוטב aspirates מח עצם, adoptively העברת מקרופאגים לעכברים. טכניקות אלו מאפשרים קביעת התפקיד מקרופאגים מקוטב לשחק בריאות ומחלות.

Abstract

מקרופאגים הם שחקנים קריטיים בתגובה החיסון המולדת לאתגר פגיעה זיהומית או, שיזם את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. מקרופאג תפקוד יכול להוביל לחוסר יכולת לעלות תגובה חיסונית מתאימה, וככזה, היה מעורב בתהליכים מחלות רבות, כולל מחלות מעי דלקתיות. מקרופאגים להציג פנוטיפים מקוטב כי המחולקים באופן כללי לשני סוגים. מקרופאגים מופעל קלאסי, מופעל על ידי גירוי עם IFNγ או LPS, לשחק תפקיד חיוני בתגובה לאתגר חיידקי בעוד מקרופאגים מופעל לחילופין, מופעלים על ידי IL-4 או IL-13, להשתתף פסולת הדחה שיפוץ רקמות היו מעורבים בהחלטה השלב של דלקת. במהלך התגובה הדלקתית in vivo, מקרופאגים נמצאים בתוך תערובת מורכבת של חדירת תאים חיסוניים ועשוי להשתתף ידי העצמת או resolvinגרם לדלקת. כדי להגדיר את התפקיד של מקרופאגים באתרו במודל חיה שלמה, יש צורך לבחון את ההשפעה של ומכלה מקרופאגים מהסביבה מורכב. לשאול שאלות על תפקידו של הפנוטיפ מקרופאג באתרו, מקרופאגים מקוטב מוגדרים phenotypically ניתן לגזור vivo לשעבר, החל aspirates מח עצם והוסיף בחזרה עכברים, עם או בלי דלדול מראש של מקרופאגים. בפרוטוקול שהוצג clodronate המכיל ליפוזומים, לעומת שולטת PBS מוזרק, שימשו כדי לרוקן מקרופאגים הגס במהלך נתרן גופרתי dextran (DSS) הנגרמת קוליטיס בעכברים. בנוסף, מקרופאגים מקוטב נגזרו vivo לשעבר והועבר עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית. הערת אזהרה על גישה זו היא כי clodronate המכיל ליפוזומים לרוקן את כל phagocytes מקצועיים, כולל שני תאים דנדריטים ומקרופגים כך כדי להבטיח את האפקט שנצפה על ידי דלדול הוא מקרופאג ספציפי, הכינון מחדש Oפנוטיפ F על ידי העברת המאמצת של מקרופאגים הכרחי. דלדול מקרופאג מערכתית בעכברים יכול גם להיות מושגת על ידי עכברים backcrossing על רקע CD11b-DTR, שהיא גישה משלימה מצוינת. היתרון של clodronate המכיל דלדול liposome בתיווך הוא שהיא אינה דורשת את הזמן ואת חשבון מעורב עכברים backcrossing והוא ניתן להשתמש בעכברים ללא קשר לרקע של העכברים (C57BL / 6, BALB / c, או רקע מעורב ).

Protocol

1. המקרופאגים באוזון באמצעות Clodronate המכיל ליפוזומים ליפוזומים מאוחסנים 4 ° C. שעתיים לפני ההזרקה, הסר clodronate המכיל ליפוזומים, PBS המכיל ליפוזומים או סטרילית PBS (בקרת הזרקה) מהמקרר כדי לאפשר להם להסתגל לטמפרטורת החדר (18 מעלו?…

Discussion

מקרופאגים הם תאים phagocytic כי לשחק תפקיד חשוב במערכת החיסונית. הם אחראים ליזום את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. בדרך כלל, מקרופאגים מופעל קלאסי מופעלים על ידי IFNγ או LPS ואחראים על סילוק פתוגנים גובר תגובה דלקתית 1. לעומת זאת, מקרופאגים מופ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי "מענק סיוע למחקר" מ קרוהן קוליטיס קרן של קנדה LMS, אשר נתמכת על ידי האגודה הקנדית לגסטרואנטרולוגיה / הקנדי איגוד הבריאות של מחקר / קרוהן ו קוליטיס קרן פרס החוקר חדש בקנדה.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Clodronate-containing liposomes Clodronateliposomes.org  
PBS-containing liposomes Clodronateliposomes.org  
Sterile PBS pH7.4 Invitrogen 14190
IMDM Invitrogen 12440
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 12483
acetic acid BDH Aristar BDH3092-500MLP
Monothioglycerol (MTG) Sigma 96-275
Recombinant murine MCSF Stemcell Technologies 02951
Recombinant murine GM-CSF Stemcell Technologies 02935
Recombinant murine IL-3 Stemcell Technologies 02903
Recombinant murine IFNγ Stemcell Technologies 02746
Recombinant murine IL-4 Stemcell Technologies 02714
Cell Dissociation Buffer Invitrogen 13150-016
Rat anti-F4/80 Antibody AbD Serotec MCA497GA
Mouse anti-ArgI Antibody BD Transduction Laboratories 610708

Table 1. Specific reagents used in this protocol.

References

  1. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  2. Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
  3. Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
  4. Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
  5. Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
  6. van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
  7. Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
  8. Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
  9. Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
  10. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
  11. Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
  12. van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
  13. Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
  14. Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
  15. Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).

Play Video

Cite This Article
Weisser, S. B., van Rooijen, N., Sly, L. M. Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice. J. Vis. Exp. (66), e4105, doi:10.3791/4105 (2012).

View Video