Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen
Summary
Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van macrofagen<em> In vivo</em>, Die voortvloeien gepolariseerde macrofagen uit het beenmerg zuigt, en adoptief overdracht van macrofagen in muizen. Deze technieken laten toe de bepaling van de rol die gepolariseerde macrofagen spelen bij gezondheid en ziekte.
Abstract
Macrofagen zijn kritisch spelers in de aangeboren immuunrespons op infectueuze uitdaging of letsel, de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Macrofagen disfunctie kan leiden tot een onvermogen om een adequate immuunrespons en als zodanig, zijn in vele ziekteprocessen, zoals inflammatoire darmziekten. Macrofagen weer te geven gepolariseerde fenotypen die in het algemeen onderverdeeld in twee categorieën. Klassiek geactiveerde macrofagen, geactiveerd door stimulatie met IFNy of LPS, spelen een essentiële rol in reactie op bacteriële uitdaging terwijl alternatief geactiveerde macrofagen, geactiveerd door IL-4 of IL-13, deel te nemen aan puin wegvangen en weefselremodellering en zijn betrokken bij de resolutie fase van ontsteking. Tijdens een ontstekingsreactie in vivo, zijn macrofagen gevonden te midden van een complex mengsel van infiltrerende immuuncellen en kunnen deelnemen door verergeren of resolving ontsteking. De rol van macrofagen bepalen in situ in een geheel diermodel is worden onderzocht het effect van afbreken macrofagen van de complexe omgeving. Voor vragen over de rol van de macrofaag fenotype in situ te vragen, kan fenotypisch gedefinieerd gepolariseerde macrofagen worden ontleend ex vivo, uit het beenmerg zuigt en toegevoegd terug naar muizen, met of zonder voorafgaande uitputting van de macrofagen. In de hier gepresenteerde protocol clodronaat bevattende liposomen versus PBS geïnjecteerd controles werden gebruikt colon macrofagen afbreken in dextran natriumsulfaat (DSS) geïnduceerde colitis bij muizen. Daarnaast werden gepolariseerde macrofagen afgeleid ex vivo en overgedragen aan muizen door intraveneuze injectie. Een waarschuwing deze benadering is dat clodronaat bevattende liposomen afbreken alle professionele fagocyten, zowel dendritische cellen macrofagen, zodat om het effect waargenomen door depletie macrofagen specifieke reconstitutie of fenotype van adoptieve overdracht van macrofagen noodzakelijk. Systemische macrofaag depletie in muizen kunnen worden bereikt door het terugkruisen muizen op een CD11b-DTR achtergrond, hetgeen een uitstekende complementaire aanpak. Het voordeel van clodronaat bevattende liposoom-gemedieerde afbraak is dat het niet de tijd en kosten in terugkruisen muizen vereist en kan worden gebruikt bij muizen ongeacht de achtergrond van de muizen (C57BL / 6, BALB / c, of gemengd achtergrond ).
Protocol
Discussion
Macrofagen zijn fagocyterende cellen die een belangrijke rol in het immuunsysteem spelen. Zij zijn verantwoordelijk voor de inleiding van de aangeboren immuunrespons en de leiding van de verworven immuunrespons. Typisch, zijn klassiek geactiveerde macrofagen geactiveerd door IFNy of LPS en zijn verantwoordelijk voor het elimineren van pathogenen en het monteren van een ontstekingsreactie 1. Omgekeerd worden afwisselend geactiveerde macrofagen geactiveerd door IL-4 of IL-13 en een rol puin spoelen en weefselre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een 'Grant ten behoeve van onderzoek' van de Crohn en Colitis Foundation of Canada naar LMS, die wordt bijgestaan door een Canadese Vereniging van Gastro-enterologie / Canadese Vereniging van Health Research / Crohn en Colitis Foundation of Canada New Investigator Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 |
| IMDM | Invitrogen | 12440 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Table 1. Specific reagents used in this protocol.
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
