Intraluminar MCAO Mouse Model: kresil Violet Boyama tarafından Serebral İnfarktı Değerlendirilmesi
Summary
Farelerde intraluminal orta serebral oklüzyon modeli sunuldu. Serebral infarkt ölçüde bir nörolojik skoru ve cresyl violet boyama, TTC alternatif boyama, paralel birçok ilgi belirteçleri test etmek büyük avantajı sunarak değerlendirilir.
Abstract
İnme mortalite ve Dünyada sakatlık önde gelen nedeni üçüncü nedenidir. Tüm inmelerin yaklaşık% 80 İskemik inme hesaplar. Ancak, trombolitik doku plazminojen aktivatörü (tPA) mevcutsa akut iskemik inme tek tedavidir. Bu liderliğindeki araştırmacılar türlerde birçok iskemik inme modelleri geliştirmek için. Kemirgen modellerinde iki tip geliştirilmiştir: global serebral iskemi veya fokal serebral iskemi modeli. Kime yaklaşık% 80 trombotik veya embolik inme, orta serebral arter (MCA), model inme çalışmalar için oldukça uygundur intralüminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) topraklarında meydana hastalarda iskemik inme taklit etmek. Bu model, ilk olarak Koizumi, ve arkadaşları tarafından sıçanlarda geliştirilmiştir. 1986 1 in. Çünkü farelerde genetik manipülasyon kolaylığı, bu modeller de bu türün 2-3 geliştirilmiştir.
content "> Bu yazıda, C57/Bl6 farelerde geçici MCA oklüzyonu prosedürü sunuyoruz. Önceki çalışmalar, uç çapı, uzunluğu, şekli, ve esneklik gibi tıkayıcı fiziksel özellikleri infarkt hacmi 4 tekrarlanabilirliği için önemli olduğunu bildirdi. Burada ticari bir silikon kaplı monofilament (Doccol Corporation) kullanılmıştır. diğer büyük avantajı bu monofilament subaraknoid kanama ikna etmek riskini azaltır olmasıdır. Zeiss stereo-mikroskop Stemi 2000 kullanmak, silikon kaplı monofilament internal karotis arter girmiştir (ICA) monofilament kadar eksternal karotis arter (ECA) bir kesik yoluyla MCA tabanı tıkar. kan akımı bir tromboembolik pıhtı lizis bölgesindeki sonrası kan akımının restorasyonu taklit monofilament çıkarılması ile 1 saat sonra restore edildi İnsanlarda. serebral infarkt ölçüde bir nörolojik skoru ile ve infarkt hacmi ölçümü ile ilk değerlendirilebilir.İskemik farelerin böylece farklı post-reperfüzyon zaman onların nörolojik skoru incelendi. 2,3,5-Triphenyftetrazoliumchlorid (TTC) ile boyanarak, infarkt hacmi değerlendirmek için genellikle yapıldı. Immunhistokimya tarafından birçok kritik belirleyicileri sınamak için bir fırsat sunuyor yana yazıda cresyl violet boyama kullanılır. Bu videoda, biz MCAO prosedürü rapor; nörolojik puanları ve cresyl violet boyama ile infarkt hacminin değerlendirilmesi.Protocol
Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO) 1. Cerrahi Prosedür (Şekil 1) Geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAO) 2 yapılır – 3 aylık erkek C57BL / 6 fareler (22-28g) için. Bu protokol IRCM biyoetik komitesi hayvan bakımı tarafından onaylanmıştır. Cerrahi aletler otoklavda (60 dk için 15 psi az 121 ° C) ile sterilize edildi. Her hayvan arasında, onlar sıcak boncuk sterilizatör (15 sn) kullanılarak sterilize edilmiştir. Cerrahi masa ve diğer ekipmanlar% 70 etanol kullanılarak dezenfekte edilir. Ameliyattan önce iki saat, fareler buprenorfin (0.03 mg / kg bwip) ile analgesized edildi. Şekil 1A. Derinden izofluran% 5 ile farelerin uyuşturan ve daha sonra% 2.5 izofluran de anestezi korumak. Farelerin Vücut sıcaklığı bir ısıtma pedi ile ameliyat sırasında sabit tutulur. Kürk ve sk Dezenfekte% 70 etanol ya da Betadin ile. Tıraş inme patofizyolojisi etkileyebilecek saç parçası sürüm, microabrasions ve iltihap üretir bu yana, fare kürk tıraş etmeyin. Bir orta hat boyun kesi olun ve yavaşça yumuşak dokuların birbirinden çekin. Bir stereo mikroskop (Stemi 2000, Zeiss) altında, bir künt diseksiyon karotis arter bulmak için trakea maruz ve kasları geri çekmek için yapılır. Sol ana karotis arter (CCA) dikkatli çevreleyen doku disseke ve CCA geçici 20 mm segmente 5-0 ipek sütür kesim kullanarak geçici bir sütür (1) tıkanmasıyla edilir. Büyük bir dikkatle vagal sinir zarar vermeyecek olunmalıdır. Sol internal karotis arter (ICA) ve dış karotis arter (ECA) ve çatallanma ayırın. Bir kalıcı sütür (2) olarak distalde mümkün olduğunca, ECA etrafına yerleştirilir ve biraz sıkı başka bir geçici sütür (3) distal ECA üzerine yerleştirilirçatallanma. Kanama önlemek için bir ters eylem cımbız kullanarak sol ICA (4) klipsleyin. Büyük bir dikkatle vagal sinir zarar vermeyecek olunmalıdır. Sürekli (2) ve geçici (3) dikiş arasında ECA (5) içine bir küçük delik kesin. 1B Şekil. , 12 mm uzunluğunda 6-0 silikon kaplı (9-10mm hakkında kaplamalı silikon olan) ECA (6) içine monofilament sütür (Doccol Corporation) tanıtılması tamamen kalıcı sütür distal ECA kesip ICA içine tıkayıcı ters . Sütür sıkıca kanamayı önlemek için monofilament etrafında bağlı ve ters eylem cımbız kaldırılır. Tıkayıcı Willis daire MCA kökeni tıkanmak üzere tanıtıldı. ECA ve CCA çatallanma ötesinde 9-10 mm çapındaki ekleme durdurun. Tıkayıcı bloke edilir ve artık hareket edemez. Bakım pterigopalatin arter nüfuz edilmesine dikkat edilmelidir. ECA üzerindeki sütür (3) tig olduğunuhtly pozisyonda mono düzeltmek için bağlanmıştır. Bir AutoClip yara kapama sistemi ile cilt kapatın. Subkutan salin solüsyonu 1 ml enjekte edilir ve tüm post-kapama süresinin (60 dakika) sırasında bir kızılötesi ısıtma lambası altında fareler yerleştirin. 2. Orta Serebral Arter Kan Akım Restorasyonu Reanesthesia önce neuroscore cerrahinin başarısını değerlendirmek için kontrol edilebilir. Daha önce açıklandığı gibi fareler anestezisi ve autoclips çıkarın. Biraz monofilament çekilmesi ve kan reperfüzyon izin ECA üzerine sütür (3) açın. Sürekli kan kaybını önlemek için ECA üzerindeki geçici dikiş kapalı kravat. Monofilament yeniden kullanım için tutulur. Kan sirkülasyonu sağlamak için CCA üzerine geçici sütür (1) sökün. Yara kapatın. Farelerde subkütan başka 1 ml serum fizyolojik verilmelidir. 1 saat boyunca ısıtma kızılötesi lamba altında fareler yerleştirin. Hayvan hareketliliği kavuşur emin olduktan sonra, fare kafesinden döndürülür ve ısıtma pedi ve 72 saat için havlu altında bıraktı. Kafesin sadece yarısı fareler çevrelerini seçmek için izin ısıtma pedi üzerine yerleştirilir unutmayın. Ameliyat sonrası kilo kaybı genel olarak görülmektedir, çünkü püre yemek yeme teşvik etmek için bir Petri tabağına yerleştirilir. On iki saat ameliyat sonrası, fareler buprenorfin (0.03 mg / kg bwip) başka bir doz verildi. 3. Sham Operasyonu Sham operasyon için tüm prosedürleri tıkayıcı takılı olmadığından haricinde aynıdır. 4. Neuroscore Nörolojik defisit sadece reperfüzyon sonrası ve yaralanma şiddetinin derecesi sonraki tahmini tMCAO başarısının değerlendirilmesine olanak sağlar. Önceden 5 açıklandığı gibi nörolojik defisit atacak </ Sup> ve 1, 24, 48 ve 72 saat sonrası reperfüzyon gerçekleştirildi. Bir genişletilmiş altı maddelik ölçek kullanılmıştır: 0: Normal. 1: hafif kuyruk tarafından yakalandı zaman veya tutarsız rotasyon olmadan davranışı çizerek, karşı tarafa döndürmek için <% 50 girişimleri. 2: hafif çizerek tutarlı, karşı tarafa döndürmek için>% 50 girişimleri. 3: güçlü, tutarlı ve çizerek acil, fare burnu neredeyse kendi kuyruğunu ulaşan, fazla 1-2 saniye için bir dönüş konumunda tutar. 4: barreling içine ilerleyici ağır dönme, refleks yürüme veya düzeltilmesi kaybı. 5: komadaki veya ölmek üzere. 5. Kresil Menekşe Boyama (Şekil 2) PBS çözeltisi perfüzyon takiben, beyinleri hızla izopentan dondurulmuş ve -80 ° C'deC. Fare beyinleri de planlanan immünohistokimyasal çalışmalar bağlı olarak,% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edilebilir. Koronal beyin kesitleri (17 um) Kriyostat-kesikler yapılmıştır. Her 30 üzerinden bir bölümü temsil eden bir beyin hasarı ile aynı slayt üzerinde toplanır. Hacim ölçümü için, 2 adet kaydırak (Scion Corporation, Frederick, MD) lezyon değerlendirmek için kullanılan cresyl violet boyama ve görüntü analiz sistemi ile boyanmış. Yaralanma ses keyfi birimler (piksel) hesaplanır, ve her bölüm için kontralateral olmayan lezyonlanan alanının bir yüzdesi olarak ifade edildi. Diğer slaytlar immünohistokimyasal çalışmalar için -80 ° C'de tutulur. Alternatif olarak, PFA-sabit beyin vibratome ve gibi Han ve ark. (2009) 6 tarafından önerilen ölçülen infarkt hacmi ile 30-50 mikron de kesilebilir.
Representative Results
Neuroscore değerlendirme tMCAO inme sonrası başarısını onaylar ve tMCAO post-reperfüzyon verimliliğini belirler. Bizim elimizde, tüm fareler, en azından hafif bir tutarlı kıvırma (neuroscore 2) ve nörolojik kusurların en fazla 72 saat için genel olarak stabil olan sunulan lümen içi prosedürüne tabi tutulmuştur. Çoğu fareler hafif tutarlı curling (neuroscore 2) sergilerler. Kıvrık olmaması gösteren Fare çalışmanın dışında tutulmuştur. Ancak, neuroscore değerlendirilmesi bize yaralı hipokampus ve sağlam bir hipokampus olanlar ile fareler arasında ayrım izin vermez. Mortalite subaraknoid kanama meydana gelmedi düşündüren, ameliyat gün boyunca gözlenmiştir. Subaraknoid kanama bir fare tespit edildiğinde, bu bir sistematik analizi çıkarılmıştır. Ev yapımı monofilamentler daha yumuşak hale Doccol Corporation, gelen silikon kaplı monofilament kullanımı başarısını artırırtMCAO ve subaraknoid kanama azaltır. 24 saat ve 72 saat arasında Mortalite bu model% 14, genel olarak oklüzyon 60 dk Min. Gözlemlenen mortalite muhtemelen bu fare soyu içinde geniş bir enfarktüs hacmini kaynaklanmaktadır. Güçlü bir lezyon tekrarlanabilirliği de onların etki (ler) modeli değişkenliği tarafından gizli olabilir nöro molekülleri okumak için çok ilginç olan (standart sapma% 15) gözlenmiştir. TMCAO sonrasında beyin hasarı ölçüde değerlendirilmesi için, bir malzeme çok uygun bir marker 6 test etmek sahip olmak için oldukça TTC daha cresyl violet boyama (Şekil 2) kullanmayı seçti. Lezyonun boyutu oldukça tutarlıdır. Ancak, bazı farelerde, hipokampus (farelerin yaklaşık% 30) yaralı olduğunu fark ettim. O cresyl violet boyama sonrasında 1 hafta kadar uygulanabilir ilginçtir. Literatürde, beyin enfarktüsü yüzdesi değişir birindendiğer çalışma. Bu fare suşu, anestezi, beyin kesitleri kalınlığı, kullanılan monofilament ya da 6, 7 ikinci boyama seçimine bağlıdır. Şekil 1. Silikon kaplı intraluminal monofilament kullanarak orta serebral arter oklüzyonu şeması. Fare beyin ve silikon kaplı monofilament tanıtımı hazırlamak için ardışık sütür ve klibi gösteren serebral arterlerin bir. Basitleştirilmiş şeması. B. Willis daire ile monofilament pozisyonu temsil edilmektedir. . Monofilament MCA ACA, anterior serebral arter baz tıkanmak üzere ECA aracılığıyla ICA sokulur; BA, baziler arter; CCA, karotis arter; C. Willis, Willis Circle; ECA, eksternal karotid artery; ICA, internal karotis arter; MCA, orta serebral arter; PCA, posterior komünikan arter; PPA, pterigopalatin arter. Şekil 2. 72 saat sonrası reperfüzyon. İnfarktı alanı (özellikle striatum, korteks ve komşu beyin bölgeleri) sonra cresyl violet ile boyandı fare beyin Temsilcisi koronal bölümleri beyaz (cresyl menekşe tarafından boyanmadan) görünür. Yaralanma hacmi (beyaz kısmı, sağ hemisfer) ayrılmış ve kontralateral olmayan lezyonlanan alanı (sol hemisfer) bir yüzdesi olarak ifade edilir.
Discussion
Farklı zamanlı modeller hastalarda inme sonuçlarını taklit geliştirilmiştir. Inme modelinde seçimi söz konusu biyolojik bağlıdır. Intraluminal MCAO modeli hastalarda iskemik inme en yaygın türlerinden biri taklit ve Tamura modeli 4,7 daha az invaziv ve daha tutarlıdır. Bu nöroproteksiyon, neurorepair ve hücre ölümüne analizler için gerçekten ilginç bir model. Intraluminal modelinin başarısı kontrol edilmesi gereken bu tür hayvan cinsiyet, yaş ve ağırlık, sıcaklık, anestezi ve cerrahi süresi gibi birçok faktöre bağlıdır. Tıkayıcı (uç çapı, uzunluğu, şekli ve esneklik) fiziksel adap MCAO 4 tutarlılığı için kritik öneme sahiptir. Bu yazıda, Doccol Corporation 9-10 mm silikon ile kaplanmış 12 mm uzunluğundaki 6-0 monofilament kullanın. Uzunluğu tüm ICA kapsamında çünkü bu monofilament büyük avantajı subaraknoid kanama azaltmak veWillis ve PPA Circle anterior ve posterior komünikan arterlerden gelir uzunluğu, rezidüel kan akımı, engelledi ve infarkt hacmi azalır değişkenliği (bizim ellerde değişkenliğin% 15) 8 edilir. CCA sütür de infarkt hacmi 9 değişkenliği azalır.
Beyin hasarı aşağıdaki tMCAO ölçüde farklı yollar ile tespit edilebilir. Daha önce de belirtildiği gibi nörolojik hasarlar ölçülebilir. Bununla birlikte, bu arada etkin bir ölçü olması zordur. Enfarkt boyutu genellikle TTC boyama ile gerçekleştirilir. Daha yakın zamanda, manyetik rezonans teknikler, aynı zamanda, nöro-koruyucu tedavisi için özellikle ilginç bir teknoloji kullanılır. Böyle neurorepair, hücre ölümü veya hücre çoğalması olarak inme dahil yatan hücresel mekanizmaları anlamak için, immünohistokimyasal olarak farklı marker çalışması kritik ve çok bilgilendirici. Böylece, bizim protocbeyin bölüm preparatları ol bu analizlerin izin veren büyük bir avantaja sahiptir, ve kullanılan fareler sayısını en aza indirir. Ayrıca, Tureyen ark. 10. cresyl violet boyama ve TTC arasında iyi bir korelasyon olduğunu bildirmişlerdir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma CIHR EKİBİ hibe # CTP 82946, bir CIHR hibe # MOP 102741, yanı sıra Kanada sandalye # 216684 ve Strauss Vakfı tarafından desteklenmiştir. ER Kanada Kalp ve İnme Vakfı tarafından burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Description | Company | Catalogue number |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 |
| Fiber-Light High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | |
| Anesthesia system for isoflurane | ||
| Isoflurane | CDMV | 108737 |
| Heating blanket | Gaymar Medsearch | TP22G |
| Infrared heating lamp | ||
| Ultra fine tweezers, style 5 | Electron Microscopy Sciences | 78320-5TI |
| Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 |
| Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades | Electron Microscopy Sciences | 77926-5S |
| Negative action tweezers, style KOPINC 5 | Electron Microscopy Sciences | 72850-F |
| Dissecting scissors 5 1/2″ Straight | Cedarlane | 72960 |
| Autoclip starter set | Harvard apparatus | 34-0557 |
| BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk | Fisher | 01-804-5 |
| 5-0 suture | Harvard apparatus | 517763 |
| Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H | CDMV | 6167 |
| 12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture | Doccol Corporation | 60SPRePK5 |
| Seringes 1ml | Fisher | 14-823-2F |
| Needles 26G1/2 | Fisher | BD-305111 |
| C57BL/6 mice | IRCM |
References
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. r. a. i. n. infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia. Neuroreport. 5, 293-296 (1993).
- Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia. Stroke. 25, 165-170 (1994).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition. J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia. J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).
- Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor. Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).
- Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke. J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 131-192 (2003).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
Tags
Mouse ModelIntraluminal MCAOCerebral Infarct EvaluationCresyl Violet StainingStrokeIschemic StrokeAcute Ischemic StrokeIschemic Stroke ModelsRodent ModelsGlobal Cerebral IschemiaFocal Cerebral IschemiaMiddle Cerebral Artery OcclusionKoizumi Et Al.Genetic Manipulation In MiceTransient MCA Occlusion ProcedureInfarct VolumeCommercial Silicon Coated MonofilamentsSubarachnoid HemorrhagesZeiss Stereo-microscope Stemi 2000
Cite This Article
Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining. J. Vis. Exp. (69), e4038, doi:10.3791/4038 (2012).