腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

一過性中大脳動脈閉塞（MCAO） 1。手術の手順（ 図1） 一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）が2日に行われる – 3ヶ月の雄のC57BL / 6マウス（22〜28グラム）まで。このプロトコルは、IRCM生命倫理委員会の動物のケアにより承認された。手術器具はオートクレーブ（60分、15 psiで121°C）で滅菌した。それぞれの動物の間に、彼らは熱いビーズ滅菌器（15秒）を使用して滅菌した。手術テーブルと他の機器を70％エタノールを用いて消毒されています。 手術2時間前に、マウスをブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）でanalgesizedた。 図1A。 深くイソフルラン5％のマウスをanaesthetizeその後イソフルラン2.5％で麻酔を維持している。マウスの体温は、加熱パッドを備えた手術中に一定に保たれる。 毛皮やSKを消毒70％エタノールまたはベタジンとインチシェービングは、脳卒中病態に影響を与える可能性があり毛髪断片リリース、microabrasionsや炎症を生成するので、我々は、マウスの毛皮を剃っていません。 正中頸部切開を加え、穏やかに軟組織を引き離す。 ステレオ顕微鏡（STEMI 2000、ツァイス）の下では、鈍的切開、気管を露出し、頸動脈を見つけるために筋肉を撤回するために実行されます。 左総頸動脈（CCA）を慎重に周囲の組織から解剖され、CCAは、一時的に20ミリメートルのセグメントに5から0絹縫合糸のカットを使用して、一時的な縫合（1）で閉塞されています。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。 左内総頸動脈（ICA）と外部の総頸動脈（ECA）の分岐を分ける。永久的な縫合糸（2）のように遠位になるべく、ECAの周囲に配置されており、ややタイトな別の一時的な縫合（3）から遠位ECAの上に置かれる分岐。 出血を避けるために逆作用ピンセットを使用して、左のICA（4）クリップ。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。 永久的な（2）と一時的な（3）縫合糸の間にECA（5）に小さな穴を開けます。 図1B。 、12ミリメートル、長さ6から0シリコン被覆（9-10mm程度被覆したシリコンです）ECA（6）にモノフィラメント縫合糸（Doccol株式会社）を導入し、完全に永久的な縫合糸の遠位にECAをカットし、ICAにオクルダーを反転。縫合糸は、しっかりと出血を防ぐためにモノフィラメントの周り縛られ、逆作用ピンセットは削除されます。 オクルダーはウィリス動脈輪におけるMCAの起点を閉塞するために導入される。 ECAとCCAの分岐を越えて9〜10ミリメートルの周りにその挿入を停止します。オクルーダは遮断され、もはや移動することはできません。ケアは、翼口蓋動脈を貫通していない注意しなければなりません。 ECAの縫合（3）TIGですhtly位置にモノフィラメントを修正するために接続されています。 autoclip創傷閉鎖システムで皮膚を閉じます。 皮下に生理食塩水の1ミリリットルを注入し、すべての閉塞後期間（60分）の間、赤外線加熱ランプの下にマウスを置きます。 2。中大脳動脈の血流の回復 reanesthesia前に、neuroscoreは、手術の成功を評価するためにチェックすることができます。 前述のようにマウスを麻酔し、オートクリップを取り外します。 少しモノフィラメント撤退や血液灌流を可能にするためのECAに縫合（3）を開きます。 永久に失血を防ぐために、ECAの一時的な縫合糸を結紮する。モノフィラメントは再使用のために保持されます。 血液の循環を可能にするために、CCAへの一時的な縫合（1）を取り外します。 傷口を閉じます。マウスは、皮下に別の1ミリリットル生理食塩水を受けるべきである。 1時間赤外線加熱ランプ下でマウスを置きます。動物は移動性を取り戻していることを確認した後、マウスをそのケージに戻され、72時間加熱パッドとタオルの下に残しました。ケージの半分だけがマウスは自分の環境を選択できるように加熱パッド上に配置されることに注意してください。手術後の体重減少は、一般的に観察されているので、マッシュポテト食べ物は食べ奨励するペトリ皿に置かれます。 十二時間後に手術、マウスは、ブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）の別の投与を受けた。 3。偽手術偽の操作は、すべての手順がオクルーダーが挿入されていないことを除いて同一である。 4。 Neuroscore 神経障害は、単に再灌流後tMCAOの成功の評価を可能にし、後で傷害の重症度の推定。前述のように神経学的欠損は、5 <を採点される/ sup>の、1、24、48および72時間後に再灌流に出演。拡張された6点スケールは使用されています： 0：正常。 1：軽度の尾が拾うとき、または矛盾した回転せずに動作を旋回、対側に回転させるための<50％の試み。 2：軽度の旋回、一貫性のある反対側に回転させるための> 50％の試み。 3：強力な一貫性と旋回即時、マウスはその鼻がほぼその尾に達して、以上の1〜2秒の回転位置を保持しています。 4：バレルに進んで深刻な回転、反射を歩いたり、立ち直りの損失。 5：昏睡状態または瀕死。 5。クレジルバイオレット染色（ 図2） PBS溶液灌流後、脳を素早くイソペンタン中で凍結されており、-80℃で保存C.マウスの脳はまた、計画された免疫組織化学の研究に応じて4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流することができる。冠状脳切片（17μm）のクライオスタット·カットが実行されます。すべての30の1つのセクションのうち、代表的な脳損傷を持っているために、同じスライド上で収集されます。ボリュームの定量のために、2スライドはクレシルバイオレット染色によって染色されており、画像解析システム（サイオン社、フレデリック、メリーランド州）は病変を評価するために使用されていました。傷害ボリュームは任意の単位（ピクセル）で計算され、各セクションの反対側の非病変領域の割合として表した。他のスライドは、免疫組織化学的研究のために-80℃に保たれている。あるいは、PFA固定脳はビブラトームととしてHan ら （2009）6が推奨する測定梗塞体積を用いて30から50μmでカットすることができます。