Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) 1. Cirugía de Procedimiento (Figura 1) Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) se realiza en 2 – a 3-meses de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones (22-28g). Este protocolo fue aprobado por el cuidado de los animales bioética IRCM comité. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron mediante tratamiento en autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min). Entre cada animal, que fueron esterilizadas mediante el calor esterilizador de cuentas (15 segundos). Mesa de cirugía y otros equipos se desinfectan con 70% de etanol. Dos horas antes de la cirugía, los ratones se analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg bwip). Figura 1A. Profundamente anestesiar a los ratones con isoflurano 5% y luego mantener la anestesia con isoflurano al 2,5%. La temperatura corporal de los ratones se mantiene constante durante la cirugía con una almohadilla térmica. Desinfecte la piel y skcon 70% de etanol o Betadine. Desde el afeitado produce liberación de pelo fragmento, microabrasiones y la inflamación que puede repercutir en la fisiopatología de golpe, no afeitarse la piel del ratón. Hacer una incisión en la línea media del cuello y suavemente separar los tejidos blandos. Bajo un microscopio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), una disección roma se realiza para exponer la tráquea y retraer los músculos para localizar la arteria carótida. La arteria carótida común izquierda (CCA) se diseca cuidadosamente del tejido circundante y la CCA está temporalmente ocluido por una sutura temporal (1) con sutura de seda 5-0 corte en segmentos de 20 mm. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago. Separe la bifurcación de la izquierda interna arteria carótida común (ICA) y la arteria carótida externa común (ECA). Una sutura permanente (2) se coloca alrededor de la ECA, como distalmente como sea posible, y otra sutura temporal ligeramente apretado (3) se coloca en la ECA distal a labifurcación. Clip de la ACI izquierda (4) utilizando unas pinzas de acción inversa para evitar el sangrado. Gran cuidado debe ejercerse para no dañar el nervio vago. Corte un pequeño agujero en la CEPA (5) entre permanentes (2) y temporal (3) puntos de sutura. La figura 1B. Introducir un 12 mm de largo 6-0 revestido con silicio (alrededor de 9-10mm es recubierto de silicona) sutura de monofilamento (Doccol Corporation) en la ECA (6), cortar completamente el ECA distal a la sutura permanente e invertir el oclusor en la ICA . La sutura está fuertemente atada alrededor del monofilamento para evitar el sangrado y las pinzas de acción inversa se eliminan. El oclusor se introdujo para ocluir el origen de la MCA en el círculo de Willis. Deje su inserción en torno a 9-10 mm más allá de la bifurcación de la CEPA y la CCA. El oclusor está bloqueado y no se puede mover más. Se debe tener cuidado de no penetrar en la arteria esfenopalatino. La sutura (3) en el ECA es tightly atado para fijar el monofilamento en posición. Cierre de la piel con un sistema de cierre autoclip herida. Inyectar 1 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar los ratones bajo una lámpara de calentamiento por infrarrojos durante todo el período de post-oclusión (60 min). 2. Restauración del Medio flujo cerebral sanguíneo de la arteria Antes de reanesthesia, la neuroscore se pueden comprobar para evaluar el éxito de la cirugía. Anestesiar a los ratones descritas anteriormente, y eliminar las autograpas. Abra ligeramente la sutura (3) en la ECA para permitir la retirada de monofilamento y reperfusión sanguínea. Permanentemente atar la sutura temporal de la ECA para evitar la pérdida de sangre. El monofilamento se mantiene para su reutilización. Retirar la sutura temporal (1) en el CCA para permitir la recirculación de sangre. Cerrar la herida. Los ratones deben recibir otra solución de 1 ml de solución salina por vía subcutánea. Coloque los ratones bajo la lámpara de calor infrarrojo para 1 hr. Después de comprobar que el animal recupera la movilidad, el ratón se devolvió a su jaula y se dejó bajo la almohadilla de calefacción y toallas para 72 hr. Tenga en cuenta que sólo la mitad de la jaula se coloca sobre la almohadilla de calentamiento para permitir que los ratones a elegir su medio ambiente. Debido post-quirúrgico de pérdida de peso se observa en general, alimentos en puré se coloca en una placa de Petri para promover la alimentación. Doce horas después de la cirugía, los ratones recibieron otra dosis de buprenorfina (0,03 mg / kg bwip). 3. Sham operación Para operaciones simuladas, todos los procedimientos son idénticos excepto que el oclusor no está insertada. 4. Neuroscore Déficits neurológicos permitir la evaluación del éxito de tMCAO justo después de la reperfusión y después de la estimación del grado de gravedad de la lesión. Déficits neurológicos se obtuvo como se ha descrito previamente 5 </ Sup> y realizaron a 1, 24, 48 y 72 horas después de la reperfusión. Una amplia escala de seis puntos se utiliza: 0: normal. 1: leve rodeando comportamiento con o sin rotación inconsistente al cogerlo por la cola, <50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral. 2: leve consistente en círculos,> 50% de los intentos para girar hacia el lado contralateral. 3: consistente fuerte e inmediato en circuito, el ratón tiene una posición de rotación de más de 1-2 segundos, con la nariz casi llegando a la cola. 4: Rotación grave progresando en encubado, pérdida del reflejo de enderezamiento o caminar. 5: comatoso o moribundos. 5. Tinción con violeta de cresilo (Figura 2) Tras la perfusión de solución de PBS, los cerebros se congelaron rápidamente en isopentano y se almacenaron a -80 °C. cerebros de ratón puede ser también perfundidos con paraformaldehído al 4% (PFA) en función de los estudios de inmunohistoquímica planificadas. Criostato de separación de las secciones del cerebro coronal (17 micras) se realizan. Una sección de cada 30 se recogen en la misma diapositiva de sufrir una lesión cerebral representante. Para la cuantificación del volumen, 2 portaobjetos se tiñen mediante tinción con violeta de cresilo y un sistema de análisis de imágenes (Scion Corporation, Frederick, MD) se usó para evaluar la lesión. El volumen de lesión se calculó en unidades arbitrarias (pixeles), y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área de cada sección. Otras diapositivas se guardan a -80 ° C para estudios de inmunohistoquímica. Alternativamente, PFA-fijo cerebro puede ser cortado a 30-50 micras utilizando vibratome y el volumen del infarto medido según lo recomendado por Han et al. (2009) 6.