Многофотонной микроскопии Сбрасывается мозга мыши выражая YFP
Summary
Многофотонной микроскопии целые органы мыши можно оптически очистка органа перед изображениями, но не все протоколы сохранить флуоресцентного сигнала флуоресцентных белков. Использование оптического метода очистки этанола на основе обезвоживания и бензиловый спирт: бензилбензоат очистки, мы показываем высоким разрешением изображения многофотонной весь мозг мыши выражения YFP.
Abstract
Многофотонной микроскопии собственной флуоресценции и генерации второй гармоники (SHG) целых органов мышей стало возможным благодаря оптическим очистка органа перед изображениями. 1,2 Однако, для органов, которые содержат флуоресцентные белки, такие как GFP и YFP, оптический протоколы очистки, которые используют метанол обезвоживания и ясно использованием бензилового спирта: бензил бензоат (Babb), а незащищенные от светло-3 не сохранить флуоресцентного сигнала. Протокол, представленные здесь, новый способ, в котором для выполнения целого органа оптического просветления на мозг мыши, сохраняя при этом сигнал флуоресценции от YFP выражается в нейронах. Изменение оптических протокол очистки, что орган обезвоживается использования этанола градуированных серии была найдена, чтобы уменьшить ущерб для флуоресцентных белков и сохранения их флуоресцентный сигнал для работы с изображениями многофотонная. 4 Использование оптимизированного метода оптической очистке этанола на основе обезвоживания и очистка от Babbв то время как защищено от света, мы показываем высокое разрешение изображения многофотонной желтый флуоресцентный белок (YFP) выражение в нейронах мозга мышей более чем на 2 мм ниже поверхности ткани.
Protocol
Discussion
В то время как стандартные органические красители, совместимые с различными органическими растворителями, и, следовательно, не представляют собой особую проблему для очистки протоколов, флуоресцентные белки часто являются менее терпимы к изменениям в растворителе. 4 Целью наст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Якова Солисом за помощь в редактировании видео.
Эта работа была частично финансируется за счет премии NSF КАРЬЕРА DBI-0953902 для MJ Левин.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
